核桃青皮提取物对苹果轮纹病抑菌效果研究

高小宽 卢 瑶 赵佳明 侯敬仪 李 淼 孟繁松

（衡水学院生命科学学院 河北 衡水 053000）

核桃(Juglans regia)为胡桃科核桃属落叶乔木，核桃青皮为核桃未成熟时外部的一层厚厚的绿色果皮，其味辛、苦，性平、涩，唐朝《食疗本草》记载核桃青皮有一定的药用价值[1]。现代药理研究表明，核桃青皮具有抗氧化、抗菌、抗癌等活性[2～4]。在核桃果实采收后，核桃青皮被当作废弃物堆在田间，持续污染环境，危害动植物的生存，破坏生态环境。但核桃青皮作为一种宝贵的可再利用资源，其很多药用价值等待被深入开发和利用[5]。

由Botryosphaeria dothidea Ces.etDeNot.引起的苹果轮纹病是一种可同时危害苹果树枝干和果实的病害，近年来在我国各大苹果产区均有发生，导致苹果的产量和品质下降，造成了严重的经济损失。同时由于其病菌的潜伏侵染特性，使其成为果实储运期的重要病害之一[6]。鉴于此，本试验拟在核桃果实不同成熟期筛选各个时期的青皮提取物，研究其对苹果轮纹病病原菌的抑菌效果，构建核桃青皮最佳抑菌效果期，通过抑菌活性测定，找到有效拮抗菌的生长期，为废弃核桃青皮资源再利用与抑菌提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料。从河北昌黎选取10 ～20 株野生核桃树，分别从核桃4 个不同时期选取核桃青皮：果实迅速膨大期(5 月初～6 月上旬)、果实硬核期(6 月初～7月初)、油脂迅速转化期(7 月上旬～8 月下旬)、果实成熟期(8 月下旬～9 月上旬)分别记做S1、S2、S3、S4。将以上不同生育期的青皮提取物分别用于苹果轮纹植物病原菌抑菌试验。供试植物病原菌为苹果轮纹植物病原菌，采自衡水旧城村苹果园带病果，经储藏15 d 后取病组织分离得到苹果轮纹病菌，4 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 核桃青皮提取物的制备。对不同生育期的核桃青皮采摘、烘干、粉粹，过100 目筛。取干燥粉末500 g，加入2 500 ml 蒸馏水，用超声波提取器提取20 min，两层纱布过滤，5 000 r/min 离心15 min，取上清液；残渣重复以上处理，取上清液，合并2 次上清液。上清液经50 ℃、50 Pa 减压浓缩，定容到500 ml，灭菌，保存备用。

1.2.2 病原菌的分离、纯化和鉴定。参照方中达的试验方法[7]。用70%酒精擦拭病果表面，无菌水冲洗干净后，切取一小块染病组织，在超净工作台中移到PDA 培养基上，于25 ℃保温培养，待长出分生孢子后进行单孢分离，纯化后在PDA 培养基上保存待用。各菌株在PDA 培养基上活化培养至菌落直径接近2/3培养皿直径时，用打孔器在菌落边缘打取直径5 mm的菌饼。

1.2.3 PDA 培养基制备。参照方中达方法进行[7]。首先用天平称量去皮的马铃薯200 g，将其切成小方形块，放入锅中，加无菌水1 000 ml，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣，将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂15 ～20 g，加热熔化加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1 000 ml。分装后，在0.103 Mpa，121 ℃高温下，高压蒸汽灭菌20 min。

1.2.4 孢子悬浮液制备。取出预先培养好的备用病原菌，在无菌条件下，往培养好的菌种培养基上加入含有0.01%Tween80 的无菌水10 ml，用已消毒的毛笔将互隔交链孢孢子从培养皿上轻轻刮下，制成浓度为1×106CFU/ml 的孢子悬浮液，悬浮液孢子计数采用在10×10 倍显微镜下每视野30～35 个分生孢子的方式。

1.2.5 对菌丝生长的抑制活性测定。采用菌丝生长速率法，在无菌条件下，分别称取0.062 5 ml、0.125 ml、0.25 ml、0.5 ml、1 ml 核桃青皮提取物，加入100 ml的PDA 培养基中，摇匀后趁热倒入直径90 mm 的培养皿内。预先培养苹果轮纹病菌，灭菌后用直径为6 mm 打孔器在菌落边沿处钻取适量菌龄相同的菌饼[8]，接种于含有杀菌剂的PDA 培养基的中央，菌丝面向下，每皿接种1 个菌饼，同等浓度做3 次重复试验。25 ℃光照培养箱培养，每天用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径，观察记录培养6 d 的结果。绘制每天菌落的生长量曲线和计算菌丝生长的抑制率。CK作为对照。菌丝生长抑制率(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)]/对照菌落直径×100%。

1.3 试验数据处理。将试验数据输入Excel 表格，将核桃青皮提取液浓度的对数设置为横轴，将抑制率几率值设置为纵轴并作图，得出毒力回归方程及有效抑制浓度(EC50)值。

2 结果与分析

2.1 不同生育期核桃青皮提取液对苹果轮纹病菌菌丝生长的影响。不同生育期核桃青皮提取液对苹果轮纹病菌菌丝生长的影响见表1。不同生育时期的核桃青皮提取液对苹果轮纹病菌抑制率随着浓度的增加呈现先升高后降低的趋势。均在0.5 ml/100 ml 时抑菌效果较好，其中生育期为S3 的核桃青皮提取液在浓度为0.5 ml/100 ml 时抑制率达到最高值，为47.59，其次是生育期为S2 的抑制率较好，值为41.30。

表1 不同生育期核桃青皮提取物对苹果轮纹病菌的抑制率

2.2 不同生育期核桃青皮提取物对苹果轮纹病菌的室内毒力测定。由表2 可知，4 个不同生育期的核桃青皮提取物对苹果轮纹病菌的毒力回归方程的相关系数均高于0.9000，说明该试验具有较高的精密度。由各时期的EC50值可知，生育期为7 月份的青皮提取物的抑菌效果最好，毒力最强，值为1.608 1，相关系数为0.953 4。

表2 不同生育期青皮提取物对苹果轮纹病菌的室内毒力测定

2.3 核桃青皮提取物对病原孢子萌发的抑制。由表3可知，不同核桃青皮提取物浓度对苹果轮纹病原的孢子萌发均有一定的抑制作用，抑制结果与菌丝结果相符，提取物浓度与相对病原的孢子萌发率呈现负相关。提取物浓度在0.5 ml/100 ml 和1 ml/100 ml 时的孢子萌发率都为60%以上，在浓度为0.062 5 ml/100 ml时的孢子萌发率仅为19.33%。结果表明，核桃青皮提取物在高浓度条件下，对苹果轮纹病病原孢子萌发有较强抑制作用。

表3 核桃青皮提取物对苹果轮纹病病原孢子萌发的抑制效果

3 结论与讨论

根据试验结果可得出结论，不同生育期的核桃青皮提取物对苹果轮纹病的菌落生长均具有不同程度的抑制效果。其中，对菌落生长抑菌效果最好的是S3生育期的核桃青皮提取物，其浓度为0.5 ml/100 ml，此时期提取物的抑菌率可达到47.59%，对病原菌的毒力最强，EC50为1.608 1 mg/100 ml。