黄芩苷对脂多糖诱导心肌细胞炎症反应和焦亡的抑制作用及其机制

靳宜静，李堪董，詹智晖，王勇

1 海南西部中心医院心血管内科，海南儋州 571000；2 海南西部中心医院神经外科

心血管疾病对人类健康威胁极大，且患病率与病死率均较高［1］。焦亡是一种由焦孔素D（GSDMD）介导的细胞程序性死亡方式，其在各种心血管疾病的发病中起着关键作用，可发生于心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、心力衰竭等疾病中［2］。细胞焦亡与炎症密切相关。核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体激活、半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）的活性转化以及白细胞介素（IL）-1β、IL-6 等炎症因子的高表达是细胞焦亡发生的关键特征［3］。与此同时，细胞发生焦亡会导致质膜孔的形成，使细胞肿胀、溶解，细胞膜破裂，从而促进炎症因子释放，进一步扩大炎症反应。因此，通过多种方式干预并抑制细胞焦亡过程在许多情况下具有心脏保护作用。炎症反应是各类心血管疾病的基本病理特征，多项研究发现，在细菌内毒素脂多糖（LPS）诱导的心肌损伤中，炎症发挥着关键作用［4］。另有研究发现，LPS会诱导磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/丝苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路的激活，从而高表达下游炎症因子并促进炎症反应及细胞焦亡的发生［5］。黄芩苷是黄芩的主要有效成分，具有抗细胞凋亡和抗氧化等生物学功能，可提高心肌功能，对心血管疾病具有的潜在保护作用［6］。但是，黄芩苷是否可能通过对心肌细胞焦亡及炎症反应的调控发挥对心肌细胞的保护作用，同时是否通过PI3K/AKT 信号通路影响心肌细胞的焦亡及炎症反应尚未可知。基于此，2021年2 月—2023 年11 月，本研究通过LPS 诱导心肌细胞损伤，观察黄芩苷对心肌细胞炎症反应及焦亡的影响并分析其机制是否与PI3K/AKT 信号通路有关。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料 大鼠心肌细胞株H9C2购自河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。DMEM 培养基、胎牛血清购自美国Gibco 公司，黄芩苷、LPS、PI3K/AKT通路抑制剂LY294002、PI3K/AKT通路激活剂胰岛素样生长因子1（IGF-1）购自上海源叶生物科技有限公司，CCK-8试剂盒购自南京诺唯赞有限公司，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司，PI3K、AKT、磷酸化PI3K（p-PI3K）、p-AKT、NLRP3、GSDMD、Caspase-1、β-actin一抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠（兔）二抗均购自英国Abcam 公司。Multiskan FC 酶标仪购自美国Thermo公司，DMI1型光学显微镜系统购自德国Leica 公司，HF151 型二氧化碳培养箱购自武汉益普生物科技有限公司，DYCZ-24KF 型四板垂直蛋白电泳仪购自北京六一生物科技有限公司，ZF-288 型凝胶成像系统购自上海金鹏分析仪器有限公司。

1.2 黄芩苷干预浓度筛选及细胞分组处理 心肌细胞株H9C2复苏培养于完全培养基中，置于70%～80%湿度、37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每隔3 d换一次细胞培养液。取对数期H9C2细胞接种到96孔板，分为对照组（不做干预），LPS组（以10 µg/mL LPS刺激24 h构建体外细胞损伤模型［7］），黄芩苷组（LPS构建体外细胞损伤模型后分别加入10、20、40、80 µmol/L黄芩苷），干预24 h后加入10 µL CCK-8溶液培养2 h，酶标仪测定450 nm处的光密度（OD）值，计算细胞活力。细胞活力=（LPS 组或实验组OD 值/对照组OD值）×100%。结果显示，对照组、LPS 组及10、20、40、80 µmol/L 黄芩苷组细胞活力分别为100.00% ±9.22%、58.21% ± 5.89%、82.33% ± 8.42%、69.00% ± 7.32%、68.67% ± 7.03%、43.00% ±4.41%，LPS 组细胞活力低于对照组，10、20 µmol/L黄芩苷组细胞活力高于LPS组，选取细胞活力最佳的10 µmol/L 黄芩苷进行后续实验。而后取对数期H9C2细胞分为对照组、LPS组、黄芩苷组、抑制剂组、黄芩苷+抑制剂组及黄芩苷+激活剂组，除不做干预的对照组外均给予10 µg/mL LPS刺激24 h构建细胞损伤模型；黄芩苷组在此基础上给予10 µmol/L黄芩苷，抑制剂组给予5 µmol/L PI3K/AKT 通路抑制剂LY294002［8］，黄芩苷+抑制剂组给予10 µmol/L 黄芩苷及5 µmol/L LY294002，黄芩苷+激活剂组给予10 µmol/L黄芩苷及100 ng/mL PI3K/AKT通路激活剂IGF-1［9］。每组设置3个复孔，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后进行后续研究。

1.3 细胞上清液炎症因子检测 采用ELISA 法。取干预24 h 后的各组细胞，收集细胞上清液，按照IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒说明书操作步骤，测定细胞上清液中炎症因子IL-1β及IL-6。

1.4 细胞焦亡相关蛋白检测 采用Western blotting法。取干预24 h的各组细胞，提取蛋白，定量并上样，进行凝胶电泳，转膜，利用脱脂牛奶法进行膜封闭，加入稀释后的GSDMD、NLRP3、Caspase-1及β-actin一抗4 ℃孵育过夜，加入抗鼠IgG二抗稀释液，室温孵育2 h，进行3次洗涤后加入显影液，在凝胶成像系统中进行图片采集。蛋白灰度用Image J图像分析软件确定，内参为β-actin，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值表示GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白的相对表达量。

1.5 细胞PI3K/AKT通路相关蛋白检测 采用Western blotting法。取干预24 h的各组细胞，参照“1.4”的方法进行蛋白提取及电泳，加入稀释后的PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT及β-actin一抗孵育过夜，加入IgG二抗稀释液，在凝胶成像系统中进行图片采集。以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值表示PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 8软件。所有数据均符合正态分布，以表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时，组间两两比较采用Dunnett'st检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞上清液IL-6、IL-1β 水平比较 与对照组比较，LPS 组细胞上清液炎症因子IL-6、IL-1β水平升高；与LPS 组比较，黄芩苷组、抑制剂组IL-6、IL-1β 水平降低；与黄芩苷组比较，黄芩苷+抑制剂组IL-6、IL-1β 水平降低，黄芩苷+激活剂组IL-6、IL-1β水平升高（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞上清液IL-6、IL-1β水平比较（pg/mL，）

表1 各组细胞上清液IL-6、IL-1β水平比较（pg/mL，）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与LPS 组比较，#P＜0.05；与黄芩苷组比较，△P＜0.05。

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2.2 各组细胞GSDMD、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达比较 与对照组比较，LPS 组细胞焦亡相关蛋白GSDMD、NLRP3、Caspase-1 表达升高；与LPS 组比较，黄芩苷组、抑制剂组GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平降低；与黄芩苷组比较，黄芩苷+抑制剂组GSDMD、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达降低，黄芩苷+激活剂组GSDMD、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达升高（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白表达比较（）

表2 各组细胞GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白表达比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与LPS 组比较，#P＜0.05；与黄芩苷组比较，△P＜0.05。

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2.3 各组细胞PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT 蛋白表达比较 与对照组比较，LPS组PI3K/AKT通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT 表达升高；与LPS 组比较，黄芩苷组、抑制剂组p-PI3K、p-AKT 蛋白表达水平降低；与黄芩苷组比较，黄芩苷+抑制剂组p-PI3K、p-AKT 蛋白表达降低，黄芩苷+激活剂组p-PI3K、p-AKT 蛋白表达升高（P均＜0.05）；各组PI3K、AKT 蛋白表达比较无统计学差异。见表3。

表3 各组细胞PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表达比较（）

表3 各组细胞PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表达比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与LPS组比较，#P＜0.05；与黄芩苷组比较，△P＜0.05。

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3 讨论

黄芩苷是一种从紫草科黄芩根部提取的黄酮类活性物质，已被用于治疗癌症、骨关节炎、肾炎和肝炎等多种疾病［10］。研究表明，黄芩苷具有抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡活性［11］。既往研究发现，黄芩苷能够通过减弱缺氧/复氧诱导的损伤来保护大鼠心肌细胞［12］。XUE 等［13］研究发现，黄芩苷可通过抑制芳基烃受体表达减轻心肌缺血炎症损伤。LIU 等［14］研究表明，黄芩苷可通过调节丝裂原活化蛋白激酶通路来减轻大鼠心肌梗死造成的心肌损伤。本研究结果显示，LPS 组H9C2 细胞活力低于对照组，而10、20 µmol/L 黄芩苷组H9C2 细胞活力高于LPS 组，提示黄芩苷可有效提高大鼠心肌细胞损伤模型的细胞活力，具有心肌细胞保护作用。

GSDMD 是GSDMs 家族的一员，近期被确定为炎症小体的新组分，是焦亡的执行因子。GSDMD 可介导膜孔形成、细胞肿胀和溶解，并且Caspase-1 对GSDMD 的切割诱导了细胞焦亡发生，是促炎介质IL-1β 分泌所必需的，与心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病密切相关［15］。炎症小体在细胞焦亡中发挥重要作用，可诱导炎症反应，调节多种生物过程，包括转录、抗原递呈、自噬、胚胎发育等［16］。近年来发现，中药单体成分也能通过影响NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡发挥抗心肌损伤作用。XU等［17］研究发现，黄芩苷可缓解心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌舒张功能障碍，改善心肌结构异常，抑制NLRP3 炎症小体的激活、心肌细胞凋亡和炎症反应并促进细胞自噬。本研究结果显示，H9C2 细胞经LPS 刺激后细胞上清液中IL-6、IL-1β水平以及细胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达升高；在加入黄芩苷处理或PI3K/AKT 通路抑制剂后，扭转了上述指标的变化，提示黄芩苷对LPS造成的心肌炎症反应有一定的保护作用。而与黄芩苷组比较，黄芩苷+抑制组细胞上清液中IL-6、IL-1β水平以及NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表达降低；黄芩苷+激活剂组上述指标趋势相反。

PI3K/AKT/mTOR 信号通路是与心肌保护相关的经典通路。研究表明，该通路的激活可以通过激活内皮型一氧化氮合酶介导抗细胞凋亡作用，并能够调节线粒体通透性转换孔的开放而发挥心肌保护作用［18］。GUO 等［19］研究发现，胡椒碱能通过上调miR-383 表达抑制PI3K/AKT 信号通路来预防心肌缺血再灌注损伤中的细胞焦亡。但关于黄芩苷能否通过调控PI3K/AKT 信号通路发挥对心肌损伤的保护作用的研究尚未见报道。本研究结果显示，经LPS 刺激后，PI3K/AKT 通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT 表达升高；而加入黄芩苷处理或PI3K/AKT通路抑制剂后，扭转了上述指标的变化。与黄芩苷组比较，黄芩苷+抑制剂组p-PI3K、p-AKT 蛋白表达降低，黄芩苷+激活剂组上述指标趋势相反。这提示黄芩苷对LPS诱导的心肌细胞损伤的抑制作用可能是通过下调PI3K/AKT通路磷酸化实现的。

综上所述，黄芩苷能够在LPS 诱导的大鼠体外心肌细胞损伤模型中抑制细胞炎症反应及焦亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT 信号通路激活有关。本研究从细胞功能方面揭示了黄芩苷在LPS 诱导的H9C2细胞中的作用，提示黄芩苷对LPS诱导的大鼠心肌细胞损伤具有一定的治疗效果。但是对于PI3K/AKT 信号通路具体如何影响细胞炎症反应以及焦亡尚不明确，并且LPS 诱导的细胞死亡以及黄芩苷是否通过减轻焦亡而改善细胞活力、迁移、侵袭等，需要进一步利用基因或药理手段确定。