丁香酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤的抑制作用及其机制

朱秋梦，石佳琦，吕玮，张昕，肖云峰，2

1 内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110；2 内蒙古医科大学新药安全评价研究中心

早期恢复血流是缺血性心脏病常见的治疗策略。在心肌梗死及再灌注初期，心肌细胞发生坏死、凋亡，导致心肌细胞数量减少，引起心功能不全。再灌注治疗可缩小心肌梗死面积，保护心肌组织，但再灌注也有可能会导致进一步的心肌损伤，也称为心肌缺血再灌注损伤（MIRI）。缺血后处理是通过短暂的冠状动脉闭塞反复中断再进行灌注，可减轻再灌注损伤，从而导致心肌梗死范围缩小［1］。MIRI涉及多种复杂的病理机制，研究显示其与钙超载、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和自噬等密切相关［2-3］。钙通道阻滞剂地尔硫䓬是治疗MIRI的常用药物，其对MIRI的改善作用已被临床证实［4］。丁香酚是一种酚类芳香族化合物，主要从丁香油中获得，具有良好的抗炎、抗氧化作用，临床上可用于心肌缺血类疾病的治疗。本课题组前期研究显示，丁香酚能够有效改善MIRI大鼠的心功能，并且发现其可通过抑制心肌细胞凋亡［5］、降低心肌细胞氧化应激水平［6］及增强心肌细胞能量代谢［7］来延缓MIRI的发展，但丁香酚在基因水平抑制MIRI的作用机制尚不明确。转录组测序技术可以定量、准确的确定RNA的表达水平，并能够通过对研究结果的比较确定细胞群中每一个分子的绝对数量［8］。由于外界刺激或环境变化时生物体中基因表达水平变化微小，2022年4月—8月，本研究采用转录组测序技术分析丁香酚作用于MIRI的差异表达基因，从转录组学水平进一步揭示MIRI的相关调控蛋白，以期阐明丁香酚改善MIRI的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 清洁级Wistar 大鼠60 只，体质量（200 ± 20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证：SCXK（京）2019-0010。丁香酚（上海源叶生物科技有限公司），盐酸地尔硫䓬（天津田边制药有限公司），乌拉坦（上海康拓化工有限公司）；TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit（美国Illumina），Qubit RNA Assay Kit（美国Life Technologies），Bioanalyzer 2100 RNA-6000 Nano Kit（美国Aglient），Bioanalyzer 2100 DNA-1000 Kit（美国Aglient），SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase（美国Invitrogen），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、肌酸激酶（CK）试剂盒、肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒（宁波美康生物科技股份有限公司）；台式离心机（德国Eppendorf），PCR仪（美国Bio-Rad）；紫外分光光度计（美国Thermo），定量仪（美国Invitrogen）。

1.2 动物分组处理与建模 健康Wistar 大鼠60只，随机分为假手术组、MIRI 组、丁香酚低剂量组、丁香酚中剂量组、丁香酚高剂量组、阳性对照组，每组10只。丁香酚低剂量组、丁香酚中剂量组、丁香酚高剂量组、阳性对照组分别给予50、100、200 mg/（kg·d）丁香酚及30 mg/（kg·d）盐酸地尔硫䓬灌胃，假手术组、MIRI组给予普通人羧甲基纤维素钠溶液灌胃，每日1次，共给药14 d。除假手术组外，各组均于末次给药1 h后采用结扎冠状动脉左前降支法建立大鼠MIRI模型。腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠，仰卧位固定，使用生物机能实验系统记录其正常Ⅱ导联心电图。待心电稳定后连接小动物呼吸机，消毒左侧胸前及腋下皮肤，备皮。使用乳突撑开器于大鼠左侧第3、4肋间撑开胸廓暴露心脏。使用7-0带线缝合针在距冠状动脉左前降支2 mm处进针，在结扎处垫一硅胶管，而后将冠状动脉左前降支及硅胶管一起结扎。术中监测Ⅱ导联心电图ST段变化，心电图结果表明，大鼠进行血管结扎手术后ST段抬高，提示心肌缺血模型建立成功。30 min后松开结扎线，取出结扎线和硅胶管，从内向外逐层缝合，再灌注24 h。假手术组开胸后，在冠状动脉左前降支处仅穿线不结扎。

1.3 血清心肌损伤标志物检测 取各组大鼠腹主动脉血，采血管静置30 min，3 500 r/min 离心10 min取血清。采用全自动生化分析仪检测血清心肌损伤标志物CK、CK-MB、LDH。

1.4 心肌梗死面积比测定 采血结束后，快速摘取大鼠心脏，将其切成4～5 片，置于0.05%的TTC 溶液中，37 ℃恒温水浴振摇染色10～15 min。将其取出，洗去多余染料；心肌片按顺序排好并拍照，应用Image J 软件分析计算左心室面积及梗死区面积。心肌梗死面积比以梗死区心肌面积占左心室面积的百分比表示。

1.5 丁香酚作用于MIRI的差异表达基因筛选 采用转录组测序筛选丁香酚作用于MIRI 的差异表达基因。各组随机取3份心脏组织，用0.9%氯化钠溶液冲洗多余血迹，于液氮中速冻，放置在-80 ℃冰箱保存。提取心脏组织总RNA 并使用DNase 消化DNA 后，用带有Oligo 的磁珠富集真核生物mRNA；加入打断试剂将mRNA 打断成短片段，以打断后的mRNA 为模板，用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链成反应体系合成二链cDNA，并使用试剂盒纯化双链cDNA；纯化的双链cDNA 再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，进行片段大小选择并进行PCR 扩增；构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer 质检合格后，使用Illumina HiSeqTM2500 或Illumina HiSeq X Ten等测序仪进行测序，产生125 bp或150 bp 的双端数据。质检合格后，使用Illumina测序仪进行测序。先使用Trimmomatic［9］软件进行质控并去除接头，在此基础上过滤掉低质量碱基以及N 碱基，最终得到高质量的clean reads。将clean reads 使用hisat2［10］比对到物种的参考基因组，软件参数为默认参数，通过基因组比对率来评估样本的情况。通过eXpress［11］软件获取落到各个心脏组织中转录本的reads 数目，使用DESeq［12］（2012） R package 的estimateSizeFactors 函数对数据进行标准化，并使用nbinomTest 函数计算差异比较的P值和foldchange 值。挑选出P＜0.05，差异倍数＞2 的差异转录本作为丁香酚作用于MIRI的差异表达基因。

1.6 差异表达基因的GO功能及KEGG信号通路富集分析 对转录组测序筛选出的差异表达基因进行GO 功能及KEGG 信号通路富集分析［13］，其中GO 分析包括生物过程、分子功能及细胞组分。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件及GraphPad Prism8.0绘图软件。计量资料采用K-S检验进行正态性分析，符合正态分布的资料以表示，组间比较行独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清心肌损伤标志物CK、CK-MB、LDH 比较 血清心肌损伤标志物CK、CK-MB、LDH水平MIRI组＞丁香酚低剂量组、丁香酚中剂量组、丁香酚高剂量组、阳性对照组＞假手术组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组血清CK、CK-MB、LDH比较（U/L，）

表1 各组血清CK、CK-MB、LDH比较（U/L，）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与MIRI组比较，#P＜0.05。

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2.2 各组心肌梗死面积比比较 假手术组、MIRI组、丁香酚低剂量组、丁香酚中剂量组、丁香酚高剂量组、阳性对照组心肌梗死面积比分别为0、36.63% ± 0.11%、28.43% ± 0.05%、17.60% ±0.03%、17.47% ± 0.01%、22.27% ± 0.06%；心肌梗死面积比假手术组＞丁香酚低剂量组、丁香酚中剂量组、丁香酚高剂量组、阳性对照组＞MIRI 组（P均＜0.05）。

2.3 丁香酚作用于MIRI 的差异表达基因筛选结果 与MIRI 组比较，丁香酚低剂量组共有1 035 个差异表达基因，其中594 个基因上调、441 个基因下调；丁香酚中剂量组共有513个差异表达基因，其中197 个基因上调、316 个基因上调；丁香酚高剂量组共有1 962 个差异表达基因，其中1 151 个基因上调、、811个基因下调。见OSID码图1。

2.4 差异表达基因的GO 功能富集分析结果 丁香酚低剂量组与MIRI组差异表达基因的GO分析结果显示，丁香酚作用于MIRI的生物过程主要涉及免疫反应、对脂多糖的反应、T 淋巴细胞增殖的正调控、病毒基因组复制的负调控等；细胞组分主要涉及细胞外空间、细胞表面、质膜外侧等；分子功能主要涉及趋化因子的活动、聚糖绑定、肽聚糖绑定、信号受体结合等（OSID 码图2）。丁香酚中剂量组与MIRI 组差异表达基因的GO 分析结果显示，丁香酚作用于MIRI的生物过程主要涉及对细菌的反应、病毒基因组复制的负调控、氧气输送以及核糖核酸酶活性的调节等；细胞组分主要涉及细胞外空间、血红蛋白复合体、染色体、着丝粒区以及着丝粒等；分子功能主要涉及低聚腺苷酸合成酶活性、载氧活性、血红素结合、信号受体结合等（OSID 码图3）。丁香酚高剂量组与MIRI组差异表达基因的GO分析结果显示，丁香酚作用于MIRI的生物过程主要涉及急性期反应、氧气输送、细胞群体增殖的正调控、细胞群体增殖的负调控等；细胞组分主要涉及细胞外空间、细胞外基质、C/D RNP 复合体等；分子功能主要涉及微管运动活动、信号受体活性、载氧活性、钙离子结合等（OSID码图4）。

2.5 差异表达基因的KEGG 信号通路富集分析结果 丁香酚低剂量组与MIRI 组差异表达基因的KEGG 分析结果显示，丁香酚作用下差异表达基因主要涉及细胞因子—细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、NOD 样受体信号通路、TNF 信号通路等过程（OSID 码图5）。丁香酚中剂量组与MIRI组差异表达基因的KEGG 分析结果显示，丁香酚作用下差异表达基因 主要涉及1 型糖尿病、抗原处理和呈递、自身免疫性甲状腺疾病、FOXO 信号通路等过程（OSID 码图6）。丁香酚高剂量组与MIRI 组差异表达基因的KEGG 分析结果显示，丁香酚作用下差异表达基因主要涉及HIF-1 信号通路、AGERAGE 信号通路、PI3K-AKT 信号通路，JAK-STAT 信号通路等过程（OSID码图7）。

3 讨论

心肌缺血是中老年人的高危疾病。溶栓治疗后，心脏组织可能会遭受进一步的损害，即MIRI［14］。MIRI 的治疗方法主要包括非药物干预（缺血预处理）和药物治疗［15］。本课题组前期研究显示，丁香酚可对MIRI产生保护作用，但目前在基因层面对其分子机制研究较少。本研究结果显示，通过结扎大鼠冠状动脉左前降支30 mim，再灌注24 h 可使大鼠心电信号ST 段抬高，显示模型建立成功。心肌缺血后，心肌细胞受损，由于细胞膜破裂，细胞中的酶被释放出细胞。通过测量血清或培养基中的酶含量，可以评估心肌细胞损伤的程度。血清中LDH、CK、CK-MB 水平可直接反映大鼠心功能损伤的严重程度［16］。本研究结果表明，与MIRI 组比较，丁香酚各剂量组大鼠血清中LDH、CK、CK-MB 水平均在不同程度上有所降低，提示丁香酚可以减轻大鼠MIRI，降低心肌组织损伤标志物LDH、CK、CK-MB水平。

超低温取各组大鼠的心脏组织，提取其RNA 进行转录组测序显示，丁香酚低、中、高剂量组可分别对MIRI 大鼠产生1 035、513、1 962 个差异表达基因，其中丁香酚高剂量组差异基因表达数量最多，有个811 下调基因，1 151 个上调基因。这提示丁香酚对MIRI 的改善作用调用了许多具有广泛功能的基因。

丁香酚作用于MIRI差异表达基因的GO功能富集分析中，丁香酚各剂量给药组主要涉及生物调节、细胞过程以及刺激反应等功能。本课题组在丁香酚各剂量组作用于MIRI 的差异表达基因中检索心脏相关差异表达基因，并未得到内容，但得到一个与线粒体和自噬相关的差异表达基因Bnip3。在测序结果中，Bnip3于MIRI组基因表达上调。有研究表明，Bnip3 可以通过触发保护性应激反应，上调细胞自噬及去除受损的线粒体，从而改善MIRI［17］。Bnip3在GO 分析与缺氧反应、线粒体、心肌细胞凋亡过程的正调控、程序性细胞死亡的调控、线粒体碎片参与凋亡过程、线粒体自噬的正调控、有氧呼吸的调控、内在凋亡信号通路对缺氧的响应有关。这提示丁香酚可能通过提高心脏组织中Bnip3 的表达，在缺氧条件下通过上调线粒体自噬来清除受损线粒体，维持机体内环境稳定，从而缓解MIRI进展。丁香酚作用于MIRI 差异表达基因的KEGG 信号通路富集分析中，丁香酚各剂量给药组主要涉及JAK-STAT 信号通路、PI3K-AKT 信号通路信号通路、HIF-1α 信号通路等。该结果与本研究团队前期研究结果一致，即丁香酚可能通过抑制心肌细胞凋亡、降低心肌细胞氧化应激水平及增强心肌细胞能量代谢来缓解MIRI 的发展。与MIRI 组比较，缺氧诱导因子HIF-1信号通路在丁香酚高剂量组上调趋势中富集得分最高且差异最明显。有研究发现，MIRI大鼠血清HIF-1α水平显著升高［18］，即HIF-1α 及其信号通路在MIRI中起到促进作用。而丁香酚干预可改变HIF-1 信号通路在心脏组织中的表达趋势，提示丁香酚可能通过调控HIF-1 信号通路来缓解MIRI 的发展，但其对HIF-1 信号通路的具体机制值得进一步研究。除此之外，FOXO 信号通路，PI3K-AKT 信号通路、铁死亡以及原发性免疫缺陷都与MIRI具有一定的相关性，值得进一步研究。

综上所述，丁香酚可抑制大鼠MIRI，其分子机制可能与HIF-1 信号通路有关。下一步可针对丁香酚通过HIF-1 信号通路缓解MIRI 的具体机制进行进一步研究，以期为MIRI的药理学预防提供更多理论依据。