NR／DAPI 共染色－荧光计数法测定自来水中的微塑料

方源， 胡文涛， 汪炎， 梅红， 宣亮， 王伟， 袁守军*

（1.合肥工业大学土木与水利工程学院， 合肥 230009； 2.工业废水及环境治理安徽省重点实验室， 合肥 230088）

微塑料（MPs）一般指尺寸小于5 mm 的塑料颗粒或碎片， 广泛分布于各类环境中。 MPs 通常具有降解难、 粒径小、 可吸附有毒物质及改变脂质和能量代谢等特性［1－2］， 因其对生态环境及人类健康可能产生的负面影响而备受关注［3］。 近年来， 有文献报道， 在饮用水水源地、 自来水厂及供水管网中检出MPs， 其丰度范围通常为每升水中含有几十个至数千个［4］， 供水行业中的微塑料污染逐步引起关注， 精准了解供水行业、 特别是管网及水龙头样本中MPs 的分布情况有利于供水安全保障工作的有效落实。

样品中MPs 的精准有效测定是开展相关研究工作的前提。 尽管对MPs 的研究已经进行了多年，但样品采集、 样品预处理、 定量和鉴定的方法还没有标准化［5］， MPs 的检测方法也呈现多样化， 主要包括目视法［6］、 光谱法［7］（傅里叶红外光谱和拉曼光谱）以及荧光染色法［8－9］等。 拉曼光谱法是目前公认的较为准确可靠的MPs 检测方法， 但由于检测时间相对较长及仪器普及性等问题限制了其被广泛使用。 Shim 等［10］提出了尼罗红（Nile Red， NR）染色法， 其特点是操作简单、 反应迅速， 可以识别出微米级粒径的小尺寸MPs［11］。 但NR 染色法最严重的缺点是对有机质的染色， 这会导致MPs 数量被高估40%～100%［12］。 为了解决这一问题， 研究发现使用NR 和4′，6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI）共染色能有效去除天然有机物［13］和微生物衍生的有机物， 这使得荧光染色法的准确性得到了提升。 此外， 样品在检测过程中， 各操作环节引起的交叉污染也是影响测定结果的重要因素， 目前类似研究鲜见报道。 针对这一问题， 本研究拟开展对样品的预处理及试验操作条件优化研究， 以期降低交叉污染， 提高NR／DAPI 共染色－荧光计数法测定自来水中MPs 的可靠性与准确度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

NR（98.0%）、 DAPI（90.0%）、 荧光标记聚苯乙烯（PS）颗粒标准品（5 ～100 μm）， 均为市售商品。

玻璃纤维滤膜（GF／F，φ47 mm， 孔径为0.7 μm）和无机氧化铝滤膜（φ25 mm， 孔径为0.2 μm）， 均为市售商品。

TX73－DP 型研究级倒置荧光显微镜、 Nicolet IS50 iN10 型显微傅里叶红外光谱仪、 DHG－9140A型干燥箱、 SX2－8－10N 型马弗炉。

1.2 自来水样品采集

（1） 随机样品采集。 2023 年2 ～3 月期间， 在合肥市不同行政区域内采集自来水龙头样本， 共计5 个采样点， 记为S1 ～S5， 其中S1、 S3 和S4 为城镇居民住宅样本， S2 为高校实验室样本， S5 为商业区样本； S2、 S3 和S5 样本来自同一水源， S1 和S4 分别来自不同水源。 采样过程中， 先打开自来水龙头， 收集约100 mL 水样于1 L 高硼硅广口瓶（预先500 ℃灼烧1 h）中， 振荡润洗10 s， 然后倒掉水样， 重复润洗2 次， 再采集约1 000 mL 水样，加盖密封， 立即送至实验室， 24 h 内分析水样中MPs 的浓度及组成情况。

（2） 不同时刻水样采集。 为了研究自来水中MPs 时间分布特征， 在S2 采样点开展不同时刻水样采集及MPs 分析， 分别于早晨（6∶00）、 中午（12∶00）和傍晚（18∶00）采集水样（n ＝3）， 具体采集方法与随机样品采集方法相同。

1.3 试验方法

1.3.1 加标回收试验

采用加标回收的方法， 考察过滤环节对MPs颗粒的收集效率。 选用荧光标记的MPs 颗粒作为研究对象， 试验结果不受玻璃器皿中残留的MPs颗粒干扰， 因此， 加标回收试验过程中未对玻璃器皿进行灼烧处理。 烧杯内倒入250 mL 滤后试验用水， 然后加入荧光标记的MPs 颗粒， 由于MPs 粒径较小（5 μm 和20 μm）， 无法做到精确加标， 因此在试验中仅控制不同的加标浓度梯度， 范围分别为： ＜100、 100 ～200、 200 ～300、 300 ～400 和400 ～500 个／L）， 并以60 r／min 搅拌30 min， 使加标后的MPs 均匀分布； 然后采用全玻璃过滤装置（孔径0.7 μm 玻璃纤维滤膜）过滤收集MPs 颗粒，使用荧光倒置显微镜测定MPs 的浓度， 测定量与加标量的比值即为加标回收率。

1.3.2 预处理对检测结果的影响

（1） 水样预处理。 为了避免有机微粒对试验结果产生影响， 试验中采用30%H2O2对水样进行预氧化处理， 主要考察H2O2浓度（VH2O2∶VH2O＝1 ∶2.5、 1 ∶5）和消解时间（24、 48 h）等参数对NR／DAPI 共染色－荧光计数法对MPs 定量结果的影响。

（2） 试验用水、 器具的处理。 试验用水、 玻璃器皿、 滤膜等材料中的MPs 颗粒可能会带入样品中， 造成测定结果被不同程度高估， 因此对试验用水及器具的预处理尤为重要。 试验分别考察清洗方法（常规清洗、 超声清洗）及干燥（灼烧）条件（300 ～500 ℃， 1 ～3 h）对NR／DAPI 共染色－荧光计数法对MPs 定量结果的影响。 试验用水为超纯水， 使用前经0.7 μm 玻璃纤维滤膜（已经500 ℃灼烧1 h 处理）过滤， 经测定， 滤后水中MPs 浓度较低， 对试验影响较小。

1.3.3 MPs 的定性与定量测定

采用上述优化后的方法， 对实际水样中的MPs进行定性和定量分析。

（1） MPs 颗粒定性分析。 水样先经过0.2 μm无机氧化铝滤膜过滤， 然后以显微傅里叶变换红外光谱仪对膜上MPs 进行定性分析。 通过透射模式（光谱范围为4 000 ～1 100 cm－1， 扫描步长为50 μm）对MPs 粒子进行扫描分析（光谱分辨率为4 cm－1， 64次叠加扫描）， 然后将每个样品谱与标准参考库进行比对定性。

（2） MPs 颗粒定量分析。 取预处理后的水样200 mL 倒入全玻璃过滤装置， 经0.7 μm 玻璃纤维滤膜过滤； 然后向滤杯中加入10 mL 超纯水， 并依次加入NR 和DAPI， 使其质量浓度分别为10 mg／L和0.5 mg／L。 样品避光放置30 min 以保证充分染色， 过滤得到染色样品。 将附有被染色MPs 的滤膜置于玻璃培养皿中， 在45 ℃下干燥12 h。 最终使用荧光倒置显微镜对膜上的MPs 进行计数定量，使用Image J 确定MPs 颗粒的尺寸。 同时， 将测定结果与拉曼光谱法进行比对， 从而评价该测定方法的准确性。

2 结果与讨论

2.1 加标回收率

荧光染色法对不同浓度梯度MPs 的加标回收试验结果如图1 所示， 在加标浓度梯度范围内， 5 μm 和20 μm 的MPs 加标回收率均保持在90% ～96%。 这表明荧光染色法表现出良好的回收效率。共存有机物的干扰和外界MPs 污染是荧光染色法必须面对的2 个挑战［14］， 而该试验中， 投加的是荧光标记的MPs， 故回收率试验不涉及样品预处理及试验用品交叉污染等因素。

图1 荧光染色法对不同浓度梯度MPs 的回收率Fig.1 Recovery of MPs with different concentration gradients using fluorescence staining method

2.2 预处理对测定结果的影响

2.2.1 水样消解预处理

取自实验室的自来水样经不同预处理条件处理后， 采用NR／DAPI 共染色－荧光计数法测定的MPs浓度， 结果如图2 所示。 依据GB 5749—2022《生活饮用水卫生标准》， 自来水中ρ（CODMn）＜3.0 mg／L， 自来水样品虽然相对较为清洁， 但水中残留的少量有机物（如腐殖质、 有机助凝剂等）仍会影响荧光染色法对MPs 的测定结果， 相对于采用H2O2消解处理， 未进行消解预处理样品中MPs 浓度被显著高估［15］， 因此， 消解预处理步骤不可缺少。 不同消解条件对MPs 的测定结果亦存在影响， H2O2浓度增加及消解时间延长， 均可能导致水样中细小的MPs 被氧化分解， 造成MPs 的测定结果被低估。在VH2O2∶VH2O＝1 ∶5， 消解时间24 h 条件下， 样品消解后， 采用荧光染色法的测定结果与拉曼光谱法接近。 因而， 确定该消解条件作为自来水样品消解预处理的最佳条件。

图2 预处理方法对MPs 定量的影响Fig.2 Effect of pretreatment methods on MPs quantification

2.2.2 试验器具预处理

玻璃纤维滤膜及玻璃器皿中的MPs 污染对检测结果的影响不可忽视， 采用过滤后的实验室超纯水定期清洗无法有效去除其中的MPs（图3）， 这可能是因为MPs 具有较高的比表面积、 较强的吸附能力和疏水性， 使其容易附着在玻璃器皿壁上［16］。针对这一问题， 采用了更剧烈的方法， 即超声清洗和灼烧， 并对其效果进行了研究。 尽管超声清洗比常规清洗表现出更高的去除玻璃器皿中背景MPs 的能力， 但超声清洗后玻璃器皿中的MPs 浓度仍保持在较高水平。 值得注意的是， 与常规清洗相比， 玻璃器皿在200 ℃灼烧3 h 后MPs 浓度下降了73%， 在500 ℃灼烧1 h 后MPs 浓度下降了97%。 此外， 粒径分布分析表明， 玻璃器皿中粒径小于20 μm 的MPs 在200 ℃灼烧3 h 后的去除效率低于70%， 而玻璃器皿中所有粒径的MPs 在500 ℃灼烧1 h 后的去除率均保持在95%以上（图3a）。 这表明在500 ℃下灼烧1 h 可有效消除MPs 污染。 虽然大多数塑料的熔点低于200 ℃， 但其热分解温度大于355 ℃［17］， 200 ℃的灼烧温度只能使MPs 熔化， 不能在有限时间内完全去除。 当温度达到高于塑料热分解点500 ℃时， MPs 可以快速分解去除［18－19］。 这为500 ℃灼烧1 h 能有效去除背景MPs 污染提供了合理的解释。

图3 预处理前后玻璃纤维滤膜和玻璃器皿中的MPs的尺寸分布Fig.3 Size distribution of MPs in glass fiber filter membrane and glassware before and after pretreatment

实验室自来水样品经H2O2（VH2O2： VH2O＝1 ∶5）消解24 h， 玻璃器皿及滤膜经500 ℃灼烧1 h， 可显著消除自来水样品中的有机物干扰及试验操作引起的污染， 试验结果如图4 所示。 水样采用荧光染色计数法（图4 中预处理＋NR／DAPI）测定MPs 的结果与拉曼光谱法相当， 可解决常规NR／DAPI 方法结果被显著高估的问题。

图4 不同方法对自来水样品中MPs 测定结果Fig.4 Determination results of MPs in tap water samples by different methods

2.3 自来水中MPs 分布

2.3.1 自来水中MPs 浓度

采用优化后的NR／DAPI 共染色－荧光计数法对不同来源的水样进行测定， MPs 测定结果见图5。

图5 不同自来水样本中MPs 的浓度Fig.5 Concentrations of MPs in different tap water samples

合肥市区5 个采样点自来水样品中， MPs 的平均浓度范围为350 ～1 250 个／L； 值得关注的是，S2、 S3 和S5 采样点源于同一水源， 但MPs 浓度存在显著差异。 可见， 自来水样品中MPs 浓度可能与较多因素相关， 如地域、 水源、 环境、 管材种类与老化程度等［20］。

2.3.2 MPs 类型与浓度分析

自来水样品中的MPs 经显微傅里叶红外光谱仪定性比对、 定量计数后， 可得出不同类型MPs颗粒的浓度， 由此可统计出水样中不同材质MPs的比例， 以S3 和S5 水样为例， 结果如图6 所示。水样S3 和S5 中， PE 占比最高， 这可能与供水管材相关； 尽管这2 个水样均来自同一水源， 但在管网中所处位置及管材老化程度等的不同， 结果亦存在差异。

图6 MPs 颗粒的种类统计Fig.6 Type statistics of MPs particles

2.3.3 MPs 尺寸与形状分析

自来水样本中MPs 的尺寸和形状分布如图7所示。 尺寸小于10 μm 的MPs 占比较高（36% ～71%）， 可见， 自来水厂过滤等工艺对较大粒径MPs 具有较好的截留去除作用。 检测到的MPs 大多数呈碎片状， 这可能与塑料碎裂的过程有关， 碎片含量多可能是由于尺寸较大的MPs 随着水流运动过程中受到剪切力而被分解成碎片， 另一方面是因为管网中MPs 的释放［21］。 纤维状MPs 主要来源于化纤织物（衣物）， 原水中的塑料纤维经净水厂滤池过滤后被有效去除， 因而出厂水及管网（龙头）样本中纤维状MPs 的比例较低。

图7 自来水样品中MPs 的尺寸和形状分布Fig.7 Particle size and shape distribution of MPs in tap water samples

2.3.4 自来水样品中MPs 的时间分布特征

在同一采样点， 不同时刻水样中MPs 的浓度存在差异， 结果如图8 所示， 早晨水样中的MPs浓度明显高于其他时间段的水样， 这是由于在夜间， 用户对供水需求低， 管网中的自来水较长时间处于静置状态， 水中的MPs 发生沉降并在缓慢水流推动作用下， 向取水口（水龙头）聚集［21］， 导致早晨初放水中MPs 浓度显著增高。

图8 不同时刻MPs 的分布特征Fig.8 Distribution of MPs at different moments

3 结论

（1） 自来水中的有机物及试验过程中的交叉污染均会导致常规NR／DAPI 共染色－荧光计数法测定MPs 的结果被高估， 对水样及试验器具进行合理预处理可解决这一问题， 处理方法为： 自来水样品采用30%H2O2（VH2O2∶VH2O＝1∶5）消解24 h；试验玻璃器皿材料在使用前经500 ℃灼烧1 h， 以去除MPs 残留。

（2） 合肥市不同区域的5 个自来水样本调研结果表明， 水样中的MPs 平均浓度范围为350 ～1 250个／L， 且以PE 为主， 小于10 μm 的MPs 占比较高， 碎片状MPs 占比最大。

（3） 不同时刻， 同一采样点的水样中MPs 浓度存在差异， 早晨样品中MPs 浓度高于其他时段。