SOX9调控肝星状细胞活化与增殖促进肝纤维化进展

熊敏莉 龚晓媛 万舒淇 罗声政

肝纤维化是各种肝脏疾病不断进展的共同阶段,包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、遗传性肝病等[1-3]。当肝脏遭受外界损伤后,肝细胞会释放大量细胞因子,招募巨噬细胞迁移至肝脏,并且诱发肝星状细胞由静息态转换成活化态。肝星状细胞是肝纤维化进程中的主要效应细胞,当肝星状细胞活化后,细胞内将合成大量的胶原纤维并沉积在细胞基质中。肝小叶中的胶原纤维不断沉积会破坏原有正常肝小叶结构,导致肝脏假小叶生成,严重损害肝脏的正常功能[4-5]。肝星状细胞的激活是肝脏遭遇损伤的自我修复过程,细胞外基质的胶原合成与分解是处在一个动态平衡之中的。因此肝星状细胞的活化与凋亡是调控肝纤维化进程的关键因素。目前一般认为,当外界损伤因素消失后,早期的肝纤维化是可以逆转的。但持续的肝纤维化进程会导致肝硬化甚至肝癌,严重影响人类的健康[6-7]。因此探究缓解甚至逆转肝纤维化的分子机制有着十分重要的意义。

性别决定区域Y相关的高迁移率族框9基因(SRY-related high mobility group-box gene 9)是SOX基因家族的重要成员。SOX基因家族是一类转录调控因子,在机体的生长发育、机体损伤修复等功能中发挥着重要的作用[8-9]。但是目前SOX9基因是否在肝纤维化的进程中发挥了作用尚不明确。本研究评估SOX9基因在肝纤维化中可能发挥的潜在作用。

材料与方法

一、材料与试剂

实验小鼠购买并饲养于上海斯莱克实验动物中心。LX2细胞系购买于武汉普诺赛生物科技有限公司,高糖DMEM培养基、青霉素-链霉素双抗、胎牛血清等细胞培养试剂购买于美国Gibco生物科技公司,用于构建肝纤维化小鼠模型的四氯化碳及玉米油等试剂购买自阿拉丁生物科技有限公司。用于敲减细胞SOX9基因表达的小干扰RNA购买自上海吉玛生物科技有限公司,Lipofectamine3000转染试剂购买自美国Invitrogen生物科技公司。用于qPCR检测的引物购买自上海生工生物技术有限公司,SYBR mix试剂盒购买自上海翌圣生物科技有限公司。用于Western Blot的抗体购买自美国Abcam生物科技公司。

二、方法

(一)动物模型构建 肝纤维化小鼠模型被分为两组,即对照组和肝纤维化造模组。12只6周龄大小的雄性C57BL/6J小鼠被随机分配至两个组中,每组6只。每组小鼠每周分别注射三次15%的四氯化碳或等量玉米油,注射量为2 μL/g体质量,持续注射六周。造模完成后,收集小鼠血清及肝脏标本用于后续实验。

(二)肝脏组织病理检查及肝酶检测 造模完成后,取适当大小的肝脏组织置于4%的多聚甲醛溶液中固定48小时。固定完成后将肝脏组织放置于包埋盒中,使用自动脱水机将肝组织进行脱水。脱水完成后的肝组织放置于溶解的石蜡池中进行包埋,制成肝组织石蜡块。将包埋于石蜡块肝组织以5 μm的厚度切片制成白片,以用于组织切片染色。

将制成的肝组织石蜡切片经由烤片、脱蜡、水化步骤后,将切片按照HE染色试剂盒及天狼星红染色试剂盒说明书相应步骤进行切片染色。染色完成后使用中性树胶封片,在光学显微镜下观察组织染色情况,并拍照存档。

(三)LX2细胞培养及活化诱导 以10%胎牛血清+1%双抗的比例加入高糖DMEM培养基中,配制成完全培养基,将LX2细胞接种于10 cm培养皿中置于37 ℃、50% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞密度长至70%左右,细胞形态良好时,行细胞接种。弃去原培养基,用PBS润洗培养皿中加入0.25%的胰酶消化细胞,以1×105密度将细胞接种于12孔板中,使用完全培养基培养24 h。将细胞分为两组即静息组与活化组,在活化组使用5 ng/mL浓度的TGFβ1细胞因子刺激LX2细胞促进细胞活化。

(四)RT-qPCR检测相关基因mRNA表达 建模后的小鼠组织及转染后的LX2细胞按照说明书使用TRIZOL提取总RNA,使用分光度仪器检测RNA浓度以及纯度。将RNA逆转录成cDNA文库用于qPCR检测。使用SYBR Premix染料进行qPCR扩增,以GAPDH基因为内参检测,相对表达量为2-△△Ct计算组织及细胞内各目的基因的相对表达。内参基因及目的基因均设三个复孔。使用的各基因扩增引物序列见下表1。

表1 qPCR相关引物序列

三、统计分析

使用SPSS 19.0软件进行统计学处理。所有实验数据以平均值±标准差表示,使用GraphPad软件进行作图。两组之间的数据统计差异使用配对t检验进行分析。P<0.05被认为差异有统计学意义。

结 果

一、肝纤维化小鼠模型组织染色情况

与造模组比,HE染色可见对照组小鼠肝脏小叶结构完整,肝细胞形态良好,排列整齐,沿小叶中央静脉放射状分布,无明显的炎细胞浸润。造模组可见肝小叶结构明显被破坏,肝细胞排列紊乱,出现了明显的细胞变性及炎细胞浸润于肝脏血管周围。Masson染色显示,对照组小鼠肝脏内无明显胶原沉积,造模组小鼠中出现了大量蓝色胶原纤维沉积于肝小叶中,肝脏正常结构被明显破坏,出现了明显肝纤维化的表现。

图1 各组小鼠肝组织HE染色(×100)、Masson染色结果(×100)

二、肝纤维化小鼠模型中,胶原相关基因及SOX9基因表达明显上升

检测二组小鼠肝脏组织中胶原相关基因的表达,结果表明(表1)与对照组相比,造模组小鼠肝脏中胶原合成的标志基因α-SMA(造模组:2.568±0.726 vs对照组:1.000±0.272,t=4.518,P=0.002)与Col1(造模组:3.125±0.775 vs对照组:1.000±0.398,t=5.454,P=0.001)的表达明显上升,这表明纤维化小鼠肝脏中的胶原生成明显增加,小鼠肝脏出现明细纤维化表现。此外SOX9基因的表达也在造模组中显著升高(造模组:1.986±0.643 vs对照组:1.000±0.288,t=3.126,P=0.014)。SOX9基因的异常升高提示其可能参与小鼠肝纤维化的进展。

三、活化的肝星状细胞中,胶原合成相关基因及SOX9基因表达显著上升

本研究使用5 ng/mL浓度的TGFβ1因子刺激LX2细胞48 h诱导肝星状细胞活化,发现LX2细胞内标志胶原生成的α-SMA(活化组:1.856±0.342 vs对照组:1.000±0.191,t=4.874,P=0.001)与Col1(活化组:2.133±0.494 vs对照组:1.000±0.129,t=4.963,P=0.001)基因表达都出现了显著升高(表2)。与肝纤维化小鼠模型相似,活化的LX2细胞中SOX9基因的表达也上升了1.718倍(表2),进一步表明了SOX9基因可能在小鼠肝纤维化的进程中发挥了重要的作用。

表2 qPCR检测各组小鼠肝组织胶原合成基因及SOX9基因相对表达

四、在LX2细胞中敲减SOX9基因后,胶原合成与细胞增殖相关基因表达降低

为了进一步了解SOX9基因在肝纤维化进程中发挥的作用,我们在活化的肝星状细胞中转染了SOX9小干扰RNA来降低活化LX2细胞内SOX9基因的表达。经小干扰RNA转染后,LX2细胞内SOX9基因的表达将为原来的0.32倍(表3),小干扰RNA敲减效果良好。随后我们检测细胞内胶原合成相关基因α-SMA(活化组:0.621±0.142 vs对照组:1.000±0.188,t=3.590,P=0.007)及Col1(活化组:0.558±0.170 vs对照组:1.000±0.130,t=4.608,P=0.002)的表达,发现两个基因均出现了显著降低(表3)。此外细胞增殖的相关基因CyclinD1(活化组:0.614±0.106 vs对照组:1.000±0.166,t=4.392,P=0.002)和PCNA(活化组:0.525±0.138 vs对照组:1.000±0.234,t=3.897,P=0.005)的表达也出现了明显下降(表3),这表明细胞增殖也被显著抑制。以上的结果表明,在体外模型中SOX9基因可以调控活化的LX2细胞的活化与增殖,敲减LX2细胞中的SOX9基因有可能起到缓解肝纤维化的作用。

表3 qPCR检测LX2细胞胶原合成基因及SOX9基因相对表达

表4 敲减SOX9基因后检测细胞活化与增殖相关基因

讨 论

肝纤维化是不同肝脏疾病进展的共同阶段,持续的肝纤维化进展常伴随着多种预后不良的表现,如肝硬化、门脉高压、肝性脑病、肝肾综合征等,严重影响了人类的健康[10-11]。目前慢性肝病已经成为了慢性疾病的最主要原因之一,包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病等都是重大的公共卫生问题。肝纤维化是慢性肝病发展的终末阶段,但是目前仍没有有效的治疗手段。因此深入探讨肝纤维化的病理生理学机制并且寻找到有效的治疗靶点就显得尤为重要。

目前对于肝纤维化的治疗主要是以病因治疗及对症治疗为主。针对病毒性肝炎主要是对应的抗病毒治疗治疗,NAFLD则是饮食习惯的调整及运动改善,自身免疫性肝病则是相对应的激素及胆汁酸治疗。但是这些治疗手段都有一定的局限性,因此寻找肝纤维化的治疗靶点有很好临床转化研究意义。在本项研究中,我们构建了肝纤维化小鼠模型以及使用了LX2人肝星状细胞系来评估SOX9基因在肝纤维化中发挥的作用。首先我们使用经典的四氯化碳腹腔注射的方向构建肝纤维化小鼠模型以及使用TGFβ1诱导LX2细胞,促进细胞活化。我们发现在纤维化的小鼠肝脏及活化的LX2细胞中,SOX9基因出现了明显的上升。因此我们推测SOX9基因可能参与了肝纤维化的进展。随后我们在活化的LX2细胞中敲减了SOX9基因的表达,我们发现胶原合成的相关基因α-SMA、Col1的表达都出现了明显下降,这表明肝星状细胞的活化受到了显著的抑制。此外细胞增殖的相关基因包括PCNA、CyclinD1的表达也出现了明显下降,这表明肝星状细胞的增殖也被明显抑制。肝星状细胞细胞的活化与增殖是肝纤维化进展中最主要的标志事件。结果表明敲减SOX9基因可以显著抑制这一过程。

SOX9基因是SOX基因家族的重要成员之一。SOX基因家族是一类与胚胎发育相关的核转录因子,由于这个基因家族与男性Y染色体上的SRY(Sex-determining region of Y chromosome)基因同源而得名[12]。SOX9基因已经被发现了在心肌纤维化和肺纤维化中都发挥了重要的作用。Gu等[13]的研究发现敲低SOX9可以通过Wnt/β-catenin信号通路减轻气管纤维化,Raza等人[14]的结果发现SOX9基因可以通过激活NAV3驱动肾脏成纤维细胞的激活,导致肾纤维化。Scharf等[15]的结果发现SOX9基因在心肌纤维化的进程中同样发挥了重要的作用,高表达的SOX9基因可以显著促进心肌细胞的的炎症反应,促进纤维化的进展。

目前SOX9基因在肝纤维化中的作用尚不明确,因此我们的研究证明了SOX9基因在肝纤维化的进程中表达明显提升,敲减SOX9基因后肝星状细胞的活化与增殖受到了显著的抑制,肝纤维化可以得以缓解,这些结果提示SOX9基因可能成为治疗肝纤维化重要的治疗靶点。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。