益心泰颗粒对慢性心衰（心气虚兼血瘀水停证）大鼠AMPK、PGC-1α的影响*

雷 洋 郭志华 刘承鑫 魏佳明 唐 云

（1.湖南省中医药研究院文献信息研究所，湖南 长沙 410006；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

慢性心力衰竭（CHF）患病率高［1］，一直是医学研究的热点和难点。能量代谢失衡可导致能量代谢重构使CHF 恶化，而改善心肌能量代谢可以改善CHF［2］。益心泰颗粒是郭志华教授团队根据多年临床经验创制的中药复方，前期研究结果表明其可以明显改善气虚血瘀水停型CHF 患者中医证候、心功能、左室射血分数（LVEF）［3］。前期基础研究还表明，益心泰颗粒可降低CHF 兔左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末期内径（LVIDs）及血清脑利尿钠肽（BNP）水平，提高LVEF［4］。心力衰竭与心室重构、心肌能量代谢密切相关。前期基础研究表明，益心泰颗粒可以改善CHF 心室重构，但未研究其是否能改善心肌能量代谢。单磷酸腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）介导多条能量代谢信号通路。故本研究从能量代谢入手，探讨益心泰颗粒对CHF（心气虚兼血瘀水停证）模型大鼠的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

70只雄性SD大鼠，SPF级，体质量200～240 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004。合格证号：430727221102889045。饲养环境：温度20～22 ℃，湿度50%左右。本实验通过湖南中医药大学伦理委员会批准（批号：LL2018010801）。

1.2 试药与仪器

益心泰颗粒，主要成分黄芪、丹参、泽泻等，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，每克含生药3.1 g。盐酸曲美他嗪片（施维雅天津制药有限公司，规格：20 mg/片。国药准字H20055465）。表阿霉素（浙江海正药业股份有限公司，规格：10 mg/瓶。国药准字H20183145）；丙硫氧嘧啶（精华制药集团股份有限公司，规格：50 mg/片。国药准字H32020795）。ELISA 试剂盒：NT-proBNP 购自武汉菲恩生物科技有限公司（货号：ER0309）。三磷酸腺苷（ATP）购自上海瑞番生物科技有限公司（货号：RF10856）；一磷酸腺苷（AMP）购自北京中科质检生物技术有限公司（货号：DECO3207）；游离脂肪酸（FFA）购自上海怡淼化学科技有限公司（货号：YXP2245）；乳酸（Lac）购自上海钦诚生物科技有限公司（货号：QC15155）。pAMPK 抗体、AMPK、PGC-1α 抗体均购自湖南艾方生物科技有限公司（货号：AF300361、AF300877、AF301056）。DYY-7C 电泳仪（北京市六一仪器厂）；SYSTEM Gel-Doc XR+凝胶成像系统（Bio-RaD公司）。

1.3 造模与分组

将60 只大鼠随机分为6 组，每组10 只，即模型组和益心泰高（10.4 g/kg）、中（5.2 g/kg）、低（2.6 g/kg）剂量组和曲美他嗪组（10 mg/kg）。按大鼠日进食量的0.02%灌胃丙硫氧嘧啶联合3.5 mg/kg 的表阿霉素腹腔注射复制CHF（心气虚兼血瘀水停证）模型［5］。正常对照组予相同量蒸馏水灌胃与腹腔注射。

1.4 给药方法

6 周后各药物组予以相应药物灌胃，模型组与正常对照组予以蒸馏水灌胃，灌胃量每次10 mL/kg，连续灌胃4周。剂量换算方法：1×大鼠体表面积/70 kg成人平均体表面积×70 kg成人每日用量。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 LVEF 药物治疗4 周后，戊巴比妥麻醉动物，超声检测仪行M超检测。

1.5.2 血清NT-proBNP、心肌组织游离脂肪酸（FFA）、腺苷三磷酸/腺苷二磷酸（ATP/AMP）、乳酸（LAC） 麻醉动物后，耳缘静脉取血2 mL，空气栓塞法处死，取出左心室心肌组织，采用ELISA 法检测，具体按试剂盒说明进行操作。

1.5.3 心肌病理组织形态学检查 多聚甲醛固定心肌组织，切片（厚10μm）、HE染色、光镜观察并采图。

1.5.4 心肌组织p-AMPK、AMPK、PGC-1α 采用Western blotting 法检测。提取总蛋白，酶标仪测定562nm 处的吸光值，绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度；配制、灌制分离胶，灌制浓缩胶，电泳，转膜，按说明书适当稀释一抗，一抗、二抗孵育，标记物显色，采用图像分析软件分析各样品的条带灰度值，以GAPDH为内对照。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理改变

模型组心肌细胞水肿、坏死，细胞核皱缩，间质增宽，少量炎细胞浸润，心肌纤维排列紊乱，部分断裂。治疗组心肌细胞损伤均较模型组有不同程度的减轻，且益心泰中、高剂量组及曲美他嗪组减轻明显。见图1。

图1 各组心脏组织病理观察（HE染色，400倍）

2.2 各组大鼠LVEF、血清NT-proBNP水平比较

见表1。模型组LVEF显著低于正常对照组（P＜0.01），而血清NT-proBNP 显著高于正常对照组（P＜0.01）。益心泰颗粒低、中、高剂量组及曲美他嗪组LVEF 均明显高于模型组（P＜0.05 或P＜0.01），而血清NT-proBNP 显著低于模型组（P＜0.05 或P＜0.01）。益心泰颗粒低剂量组LVEF 明显低于曲美他嗪组（P＜0.05），血清NT-proBNP 明显高于正常对照组、曲美他嗪组（P＜0.05）；而益心泰颗粒中、高剂量组LVEF、血清NTproBNP均与曲美他嗪组无明显差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠LVEF、血清NT-proBNP水平比较（±s）

表1 各组大鼠LVEF、血清NT-proBNP水平比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01；与曲美他嗪组比较，△P ＜0.05。下同。

n组 别正常对照组模型组益心泰颗粒低剂量组益心泰颗粒中剂量组益心泰颗粒高剂量组曲美他嗪组NT-proBNP（pg/mL）116.04±29.53 437.42±38.48*331.29±22.64#△245.37±27.21##210.16±45.08##223.73±34.40##10 10 10 10 10 10 LVEF（%）70.35±11.27 37.40±6.35*46.77±5.23#△51.32±5.84##54.71±8.16##52.85±4.70##

2.3 各组大鼠心肌组织FFA、ATP/AMP、LAC比较

见表2。模型组ATP/AMP显著低于正常对照组（P＜0.01），而FFA、LAC 显著高于正常对照组（P＜0.01）。益心泰颗粒低、中、高剂量组及曲美他嗪组ATP/AMP均明显高于模型组（P＜0.05 或P＜0.01），而FFA、LAC显著低于模型组（P＜0.05 或P＜0.01）。益心泰颗粒低剂量组ATP/AMP 明显低于曲美他嗪组（P＜0.05），FFA、LAC 明显高于正常对照组、曲美他嗪组（P＜0.05）；而益心泰颗粒中、高剂量组ATP/AMP、FFA、LAC均与曲美他嗪组无明显差异（P＞0.05）。

表2 各组大鼠心肌组织FFA、ATP/AMP、LAC水平比较（±s）

表2 各组大鼠心肌组织FFA、ATP/AMP、LAC水平比较（±s）

组 别正常对照组模型组益心泰颗粒低剂量组益心泰颗粒中剂量组益心泰颗粒高剂量组曲美他嗪组n 10 10 10 10 10 10 FFA（nmol/mg）174.30±10.27 287.45±12.35*248.74±9.20#△220.36±13.85##213.76±11.14##201.84±8.75##ATP/AMP 9.80±1.08 2.47±0.93*3.69±0.63#△4.97±1.07##5.86±1.05##6.03±1.41##LAC（nmol/mg）301.35±45.27 547.21±36.82*456.07±41.81#△391.92±45.04##364.71±28.56##352.16±44.66##

2.4 各组大鼠p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相对灰度值比较

见表3、图4。模型组p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相对灰度值均显著低于正常对照组（P＜0.01）。益心泰颗粒低、中、高剂量组及曲美他嗪组p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白相对灰度值均明显高于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。益心泰颗粒低剂量组p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白相对灰度值均明显低于曲美他嗪组（P＜0.05），而益心泰颗粒高剂量组p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相对灰度值均与曲美他嗪组无明显差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白表达比较（±s）

组 别正常对照组模型组益心泰颗粒低剂量组益心泰颗粒中剂量组益心泰颗粒高剂量组曲美他嗪组n 10 10 10 10 10 10 p-AMPK 0.68±0.15 0.14±0.05*0.20±0.06#△0.33±0.11#△0.44±0.17##0.51±0.14##AMPK 0.74±0.22 0.12±0.08*0.28±0.09#△0.41±0.08#△0.55±0.13##0.67±0.20##PGC-1α 0.98±0.18 0.16±0.05*0.32±0.08#△0.47±0.10#△0.56±0.13##0.59±0.16##

图4 各组p-AMPK、AMPK、PGC-1α蛋白表达

3 讨 论

CHF指心血管疾病所致心脏收缩舒张功能障碍而表现的一系列症状的临床综合征，其患病率高［1］。随着药物的不断更新，心衰的西医治疗方案不断完善，且随着CHF 中心的建设，方案越来越规范，取得了一定的效果，但住院率及死亡率仍居高不下。本病死亡率与癌症相当，住院患者约为2.8%［1］，故对其进行干预，显得非常重要。心脏是高能量代谢器官，CHF 发生时代谢底物发生改变，导致能量供需失衡［6］。能量代谢失衡可导致能量代谢重构而使HF恶化［2］，改善心肌能量代谢，可以抑制心肌纤维化、延缓HF发展［7］。

针对能量代谢，西医临床主要采用抑制脂肪酸氧化的药物如曲美他嗪，但其可产生酮体等有害物质［8］。故研究有效的中药制剂改善慢性心力衰竭能量代谢十分必要。气血运行，心脏的活动都与心气密切相关，心气是心脏发挥正常生理作用的原动力。心气亏虚则原动力不足，犹如现代医学所称能量不足，故有学者提出“气”与能量存在内在统一性［9］。益心泰颗粒中的君药为黄芪，其中黄芪的有效成分为黄芪甲苷，有研究表明，其可以激活AMPK 信号通路，改善心肌细胞能量代谢［10］；臣药为丹参，丹参有效成分为丹参川芎嗪，其可改善CHF 临床症状，减轻心肌能量消耗［11］。基于以上理论基础，本团队提出，益心泰颗粒可能具有改善心肌能量代谢的作用。

AMPK 是细胞能量代谢的“传感器”，能调控CHF能量稳态，以改善CHF 心功能，故逐渐成为其潜在治疗靶点［12-13］。AMPK 广泛存在于真核细胞生物中，当ATP/ADP 或ATP/AMP 的比例降低时，其大量激活而参与能量代谢的调节。心脏是高耗能器官，正常生理下，主要由FFA供能，但心肌能量代谢异常后，FFA利用减少，葡萄糖的无氧酵解供能增加，产生大量的LAC，导致心肌细胞内环境发生改变，H+、Ca2+等浓度的异常升高，导致心肌细胞损伤，进而导致心肌细胞功能障碍而加重心衰的发展［14］。PGC-1α 是一种转录调节辅助激活因子，在AMPK 磷酸化后活化，从而激活下游的核呼吸因子等，刺激线粒体生物合成，促进FFA 氧化，而改善心肌能量代谢［15］。

本研究结果表明，与正常对照组比较，模型组表现为心肌细胞水肿、坏死，细胞核皱缩，间质增宽，少量炎细胞浸润，LVEF、心肌组织ATP/AMP 比例及心肌组织p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相对灰度值显著下降（P＜0.01），而血清NT-proBNP及心肌组织中FFA、LAC含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，益心泰颗粒各剂量组及曲美他嗪组心肌细胞损伤均有不同程度的减轻，LVEF、心肌组织ATP/AMP比例及心肌组织p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白相对灰度值均明显升高（P＜0.05或P＜0.01），血清NT-proBNP 及心肌组织中FFA、LAC含量明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），说明益心泰颗粒与曲美他嗪均可明显改善CHF心肌损伤，提高其LVEF，降低血清NT-proBNP及心肌组织FFA、LAC含量，促进AMPK、PGC-1α表达，改善心肌能量代谢。

益心泰颗粒可以改善心气虚兼血瘀水停证CHF，其机制可能是促进AMPK、PGC-1α 表达，改善心肌能量代谢。AMPK 相关的能量通路繁多，本研究只选择了AMPK/PGC-1α 通路中的重要指标，以后研究有待从AMPK 相关通路研究益心泰改善CHF 的机制，并研究其相关通路中的关联。