LINC02695表达在糖尿病视网膜病变新生血管中的初步研究

袁 园,朱安民,曾 兰,龙小凤,叶 萌,唐 凯,谭 薇△

(1.遵义医科大学第一临床学院,贵州遵义 563000;2.遵义市第一人民医院/遵义医科大学第三附属医院眼科,贵州遵义 563000;3.云阳县人民医院眼科,重庆 404500;4.遵义市第一人民医院/遵义医科大学第三附属医院中心实验室,贵州遵义 563000)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)正在成为日益严重的全球健康问题。据国际糖尿病联合会估计,截至2021年全球糖尿病患者人数已达5.37亿,推测至2045年,这一数据可达7.83亿。就糖尿病患者的数量而言,中国的患者总数约为1.409亿,居世界首位[1]。DM以持续性高血糖为特征,表现为全身多处靶器官损害、大血管及微血管合并症[2]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是DM患者眼部受累后常见的微血管合并症,是工作年龄人群患糖尿病后视力障碍和失明的主要原因。增殖期糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)是导致DM患者视力丧失的常见和潜在破坏性原因,新生血管形成是其重要特征之一[3-5]。

新生血管形成的过程涉及多种因子,如近年来被广泛研究的“明星因子”血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、糖基化终产物和受体、炎症因子和趋化因子、增殖物激活受体-γ、生长因子、微RNA(microRNA)等,但PDR病理性新生血管形成的具体机制尚不清楚[6-8]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一组长度>200个核苷酸的非编码 RNA,其主要定位于细胞核或细胞质,无蛋白编码功能,缺少完整的开放式阅读框架,可剪接、加帽或者聚腺苷酸化处理[9-10]。 近年来,越来越多的证据表明,lncRNA在眼部疾病中表达异常,并且可能在DR的发生、发展中起重要作用[11-12]。LINC02695是一种新发现的lncRNA,目前在眼部疾病中尚未见相关报道,在前期研究中作者通过基因芯片发现其可能参与DR形成[13]。本研究着重探讨LINC02695对高糖(high glucose,HG)诱导下人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRMECs)的增殖、迁移和血管新生的影响及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器

HRMECs购自北京北纳创联生物技术研究院,用ECM内皮细胞培养基于37 ℃、5% CO2、95%湿度恒温细胞培养箱中培养。ECM培养基购自美国ScienCell公司,2×SYBR Green PCR mix及4%多聚甲醛购自北京索莱宝公司,CCK-8试剂及结晶紫染色剂购自上海碧云天生物技术公司,基质胶购自美国Corning公司,TRIzol 试剂购自美国Thermo Scientific公司,PrimeScriptTMRT reagent试剂盒购自日本Takara公司,LipofectamineTM2000转染试剂购自合肥白鲨生物科技有限公司。LINC02695、VEGF及β-actin引物由美国Invitrogen公司设计并合成。pcDNA-3.1-si-LINC02695、pcDNA-3.1载体购自上海吉玛制药技术有限公司。LINC02695干扰序列(si-LINC02695)共3条,均由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成,具体见表1。NanoDrop LITE分光光度计购自美国Thermo Scientific公司,CFX96实时荧光定量PCR(qPCR)仪购自美国Bio-Rad公司,i3x多功能酶标检测仪购自美国Molecular Devices公司。

表1 si-LINC02695干扰序列

1.2 方法

1.2.1细胞转染及分组

HRMECs以2×105/L接种于6孔板中,孵育24 h后进行转染。将HRMECs分为4组,分别为正常糖(normal glucose,NG)组、HG组、HG+LINC02695沉默(HG+si-LINC02695)组、HG+沉默对照(HG+si-NC)组,后2组用LipofectamineTM2000分别转染pcDNA3.1-siLINC02695和pcDNA3.1空载体,最终转染浓度为50 nmol/L。

1.2.2RNA提取和qPCR

采用TRIzol 试剂提取各组HRMECs的总RNA后,使用NanoDrop LITE分光光度计测定各组总RNA浓度,将所得的总RNA使用PrimeScriptTMRT reagent试剂盒逆转录为cDNA,以CFX96 qPCR仪进行扩增。所需的引物序列如下：LINC02695正向引物为5′-GAT CCA AGA GAT GCA GAG GCT AAG C-3′,反向引物为5′-TGT GGA GAG GCA GGC TTC AGA G-3′;VEGF正向引物为5′-CTT CGC TTA CTC TCA CCT GCT TCT G-3′,反向引物为5′-GCT GTC ATG GGC TGC TTC TTC C-3′;β-actin(内参)正向引物为5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT C-3′,反向引物为5′-TGA TCT TCA TTG TGC TGG GTG-3′。采用2-ΔΔCt公式计算LINC02695及VEGF mRNA的相对表达水平。实验重复3次,取平均值。

1.2.3CCK-8测定细胞增殖能力

各组细胞以5×104/孔接种于96孔板,培养24 h后每孔按照10∶1比例加入ECM培养基-CCK-8混合液110 mL,放入细胞培养箱1 h后于i3x多功能酶标检测仪中检测450 nm波长下细胞的吸光度[A(450)]值,同条件下检测3次。

1.2.4Transwell测定细胞迁移能力

各组细胞用含有5%胎牛血清(FBS)的NG/HG ECM培养基将其稀释为4×105/mL,接种于24孔的Transwell孔板小室内,下室加含有20% FBS NG/HG ECM培养基,于37 ℃、5% CO2、95%湿度恒温细胞培养箱培养48 h,用湿润棉签擦拭掉小室微孔膜内侧细胞,PBS清洗3遍,小室微孔膜外侧细胞用4%多聚甲醛固定20 min,0.1%结晶紫染色30 min,取下微孔膜放入载玻片上,滴1滴中性树胶封片。制片完成后置于显微镜下观察并拍照,照片用Image J软件计数。实验重复3次,取平均值。

1.2.5细胞成管能力测定

在96孔板中加入50 μL/孔Matrigel基质胶,置于37 ℃、5% CO2、95%湿度恒温细胞培养箱中1 h使其凝固,各组细胞按照4×105/mL密度接种于包被Matrigel基质胶的96孔板中,在培养箱内孵育。8 h后取出96孔板置于显微镜下观察并拍照,照片用Image J软件计数细胞成管节点数及分支数。实验重复3次,取平均值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 HG环境下的HRMECs LINC02695、VEGF mRNA表达情况

qPCR结果显示：与NG组比较,HG组中细胞LINC02695、VEGF mRNA表达水平明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

a：P<0.05。

2.2 干扰序列选择

由si-LINC02695转染细胞48 h后进行qPCR检测LINC02695表达情况,结果显示,3个siRNA-LINC02695序列中,序列2(si-LINC02695-2)的转染效率最高,且差异有统计学意义(P<0.05),故选其作为后续实验的siRNA,见图2。

①：si-NC;②：si-LINC02695-1;③：si-LINC02695-2;④：si-LINC02695-3;a：P<0.05。

2.3 HG环境下沉默LINC02695对HRMECs中VEGF mRNA表达的影响

qPCR结果显示：与HG组比较,HG+si-NC组细胞VEGF mRNA表达水平无明显变化(P>0.05),HG+si-LINC02695组细胞VEGF mRNA表达水平明显下调,差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

①：NG组;②：HG组;③：HG+si-NC组;④：HG+si-LINC02695组;a：P<0.05。

2.4 沉默LINC02695对HG诱导的HRMECs增殖的影响

CCK-8实验结果显示：与NG组比较,HG组细胞增殖能力升高,差异有统计学意义(P<0.05);与HG组比较,HG+si-NC组细胞增殖能力无明显变化(P>0.05),HG+si-LINC02695组细胞增殖能力明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

①：NG组;②：HG组;③：HG+si-NC组;④：HG+si-LINC02695组;a：P<0.05。

2.5 沉默LINC02695对HG诱导的HRMECs迁移的影响

Transwell迁移实验结果表明：与NG组比较,HG组迁移细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与HG组比较,与HG+si-NC组迁移细胞数无明显变化(P>0.05),HG+si-LINC02695组迁移细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),见图5。

A：Transwell迁移图;B：定量统计分析图;①：NG组;②：HG组;③：HG+si-NC组;④：HG+si-LINC02695组;a：P<0.05。

2.6 沉默LINC02695对HG诱导的HRMECs管形成的影响

管形成实验结果表明：与NG组比较,HG组细胞节点数和分支数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与HG组比较,HG+si-NC组细胞节点数和分支数无明显变化(P<0.05),HG+si-LINC02695组细胞管形成数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),见图6。

A：各组细胞成管图;B：细胞成管节点及分支数定量统计分析图;①：NG组;②：HG组;③：HG+si-NC组;④：HG+si-LINC02695组;a：P<0.05。

3 讨 论

目前普遍认为,DR是全世界工作年龄人群中糖尿病相关视力损伤或丧失的主要原因[14-15]。其治疗方式主要有控制高血糖、高血压、高血脂、激光治疗、抗VEGF治疗及玻璃体切除术等,尽管广泛的临床试验证明了这些治疗方法的应用价值,但这些疗法在临床应用中不可避免地受到一定的限制,治疗负担重、难度大等挑战依然存在[16-19]。因此,有必要对DR进展的病理过程和相关参与因子进行深入探讨,为DR的诊断和治疗提供新思路。

病理性的新生血管形成是PDR的一个重要特点。由于新生血管不稳定,血管内容物容易漏出,造成玻璃体积血和视网膜脱离,最终导致视力丧失[20-22]。近年来越来越多的研究发现lncRNA广泛存在于眼内各种组织中,其异常表达可能参与眼部各种疾病,其中就包括DR。大量研究发现,lncRNA的异常表达与DR病理过程相关,并被认为是参与病理性新生血管形成的重要调节因子之一[23-26]。例如有研究发现,lncRNA MALAT1可能通过调节miR-205-5p/VEGF-A参与DR的病理过程,敲低lncRNA MALAT1后可在HG条件下抑制HRMECs增殖、迁移和管形成[27]。

既往有研究分别提取了患有PDR或特发性黄斑裂孔患者的玻璃体液,并通过基因芯片技术对两者差异的lncRNA进行检测,随后用qPCR进行验证,发现LINC02695在HG组中表达上调[6],与芯片结果相符,但LINC02695在DR中的作用及具体分子机制尚未见研究报道。

本研究旨在探讨LINC02695在HG环境下HRMECs中的表达及作用,以期为DR的防治提供新靶点。VEGF为目前已被广泛认可参与DR发展并应用于临床的因子[28-30],故本实验还研究了LINC02695与VEGF的关系。本研究通过体外细胞实验发现HG诱导下HRMECs中的LINC02695及VEGF表达上调,HRMECs的增殖、迁移及新生血管形成明显增加。这说明HG环境可能会促进HRMECs增殖、迁移及新生血管生成。本研究还发现LINC02695可能是参与调节HG环境下HRMECs的新生血管过程的因子之一,通过沉默LINC02695发现其可抑制HG诱导下的VEGF表达,而且也同时抑制HG环境下的HRMECs增殖、迁移及新生血管形成。上述研究表明,LINC02695可能在DR发生和发展中起着重要作用。

综上所述,本研究发现LINC02695可能通过调节VEGF参与HG诱导的HRMECs增殖、迁移及血管生成,为进一步探讨LINC02695在DR发生、发展中的分子机制提供了参考,这或许能在未来为DR的防治提供全新靶标。但是LINC02695参与DR发挥作用的具体机制仍不清楚,还需进一步研究。