卵巢癌顺铂耐药转录组学分析和拮抗剂筛选的研究*

王晓晓,杜佳慧,李莉蓉 ,郭伟强,刘松柏△

(1.苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室,江苏苏州 215009;2.苏州科技大学,江苏苏州 215009)

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一[1],在所有妇科恶性肿瘤中,卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,但死亡率居第1位[2]。由于早期卵巢癌患者没有或只有很少的特定症状,同时缺乏有效的筛查方法,70%以上的卵巢癌患者在晚期(Ⅲ、Ⅳ期)才被诊断出来[3-4]。手术联合化疗是目前治疗卵巢癌的主要方法,但由于耐药和复发率较高,导致患者的生存率很低,2007—2013年Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌患者的5年生存率分别为42%和26%[5-6]。因此,研究卵巢癌新的替代治疗策略势在必行。

铂类化疗药是临床上最常用的化疗药物,共分为3代。顺铂(DDP)作为第一代铂类化疗药,它可以用于多种癌症的治疗,如睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌、头颈部癌症、胃癌等[7-9]。DDP主要通过与DNA合成DNA-铂加合物诱导DNA损伤反应来杀死肿瘤细胞[7]。以DDP为基础的化疗在卵巢癌的早期治疗中效果很好,然而耐药是卵巢癌化疗中最常见的现象之一[8-9]。针对DDP耐药,目前临床多应用DDP联合其他化疗药物治疗,成功降低了药物毒性和肿瘤的耐药性。临床研究表明,在DDP治疗各种肿瘤的基础上加入5-氟尿嘧啶、紫杉醇、吉西他滨、阿霉素等都可获得良好的疗效并减少不良反应[10-12],但仍需要更多的研究来提高抗癌活性,降低毒性和交叉耐药性或改善药理特性。因此,了解卵巢癌DDP耐药的发生机制及寻找拮抗DDP耐药的新疗法或新药物成为卵巢癌治疗研究的热点和重点之一。

转录组是特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,包括编码的mRNA和非编码RNA。转录组测序是基于Illumina测序平台,研究特定组织或细胞在某个时期转录出来的所有mRNA,转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点,通过新一代高通量测序,能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。有研究表明,细胞外基质(ECM)不仅在调节细胞黏附、形态和运动方面发挥关键作用,而且还介导肿瘤的发生、进展和转移扩散[13],“ECM-受体相互作用通路”“PI3K/Akt信号通路”和“细胞黏附分子(CAMs)”通路与细胞行为相关,并可能在调节细胞迁移和死亡中发挥核心作用,且在这几条通路中的整合素亚基基因家族(ITG)在肿瘤进展和癌症治疗中发挥重要作用[14-15]。本研究旨在探讨卵巢癌DDP耐药的分子机制,并寻找克服卵巢癌耐药的新策略及DDP耐药的新方向,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

卵巢癌细胞系A2780购自北纳生物科技公司;1640培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自德国SERANA公司;胰酶和双抗均购自美国Hyclone公司;质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;逆转录和实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自日本Takara公司;引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成;单克隆抗体购自英国Abcam公司;山羊抗小鼠及山羊抗兔抗体购自上海碧云天生物有限公司;OTS964、CPT、AZD7648、雷公藤内酯醇(TPL)及奥拉帕尼等小分子抑制剂购自上海陶术生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及耐药细胞构建

用不同浓度的DDP刺激A2780,在培养箱中培养48 h后换不含药培养基继续培养,待达到对数生长期后重复剂量诱导,诱导剂量为0.2～64.0 μg/mL,最终获得DDP耐药细胞A2780-DDP,诱导成功后,需在培养基中添加1.0 μg/mL的DDP以维持其耐药性。A2780和A2780-DDP均使用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的1640培养基,并在37 ℃,5% CO2培养箱中培养。

1.2.2CCK-8细胞活力检测

细胞增殖能力及药物敏感性使用CCK-8试剂进行检测,将A2780和A2780-DDP按照5 000/孔的密度接种到96孔板中,24 h后在培养基中加入不同浓度的DDP,72 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂,2 h后使用酶标仪检测450 nm处吸光度,绘制细胞生长抑制曲线,并计算半抑制浓度(IC50)值。按上述方法将细胞接种到96孔板中,使用CCK-8试剂分别检测0、24、48、72、96 h的细胞活力,并绘制细胞增殖曲线。

1.2.3细胞划痕实验

细胞迁移能力通过划痕实验进行验证,分别将A2780和A2780-DDP按照1.0×107个每孔的密度接种到6孔板中,培养至细胞密度80%,用200 μL的移液器吸头做划痕,磷酸盐缓冲液清洗细胞并拍照;24 h后再次拍照,测量划痕的距离,与0 h进行比较,验证细胞的迁移能力。

1.2.4细胞迁移和侵袭能力检测

使用Transwell小室(Costar)检测细胞迁移和侵袭能力,胰酶消化细胞,800 r/min离心3 min后用磷酸盐缓冲液洗1遍,再次离心后,用无血清培养基重悬,吹散混匀并计数,将细胞密度稀释至50万/mL;在24孔Transwell板中加入500 μL含10%血清的正常培养基,放入小室,加入200 μL无血清培养基稀释好的细胞悬液。24 h后取出小室,吸去上层培养液并用棉签轻轻擦拭除去上层细胞,加入磷酸盐缓冲液洗1遍,加入时注意不要碰到膜。然后用0.1%的结晶紫染色液染色10 min,吸弃染色液,磷酸盐缓冲液清洗3次,用镊子小心揭下膜,吸干残留液体并晾干后转移至载玻片上,用中性树胶封片,显微镜拍照并计数,比较细胞迁移和侵袭能力。

1.2.5RNA-Seq分析

分别收集A2780和A2780-DDP进行了转录组学测序,将A2780作为对照对象,A2780-DDP作为实验对象,各重复3次。对测序结果原始图像数据利用软件Bcl2fastq(v2.17.1.14)进行图像碱基识别和初步质量分析后得到原始测序数据。对测序数据进行参考序列比对分析,可变剪切分析,新转录本预测及SNV和InDel分析,并通过Htseq软件计算基因表达水平,该软件采用RSEM软件计算基因表达水平,衡量基因表达水平的标准为FPKM值,通过所有基因的FPKM的分布图及盒形图对不同实验条件下的基因表达水平进行比较。对检测的结果按照差异显著性标准进行筛选,即差异基因表达变化2倍以上且q值[错误发现率(FDR)/校正后的P值(Padj)]统计基因显著性差异表达上下调情况。最后,通过差异基因GO富集分析和KEGG富集分析对差异表达基因进行聚类分析。

1.2.6qPCR

根据高通量测序结果,筛选出6个预测有表达差异的基因,利用Primer premier5.0软件进行引物设计,并经上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。采用SYBR GreenⅠ法进行qPCR,验证转录组测序结果的准确性。以逆转录产物cDNA为模板,严格按照罗氏qPCR试剂盒说明书进行实验操作。每个模板设置3个重复,每个基因设置3个阴性对照,总反应体系为20 μL,反应条件是95 ℃,15 s;57 ℃,30 s;72 ℃,30 s;40个循环。

1.2.7Western blot

从标本中提取蛋白质并用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度,然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,再用5%的脱脂奶粉封闭,一抗孵育4 ℃过夜,用PBST洗涤膜3次,并与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1 h。然后将PVDF膜在PBST中再次洗涤并使用增强化学发光试剂盒显影,显影结果用ImageJ软件进行条带定量分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 A2780-DDP细胞株的构建

通过药物浓度递增的方法成功构建了耐药细胞株A2780-DDP。CCK-8结果发现,随着DDP浓度的增加,A2780的生长受到抑制,而A2780-DDP则表现出明显的耐药性,且使用实时细胞分析仪器检测发现A2780和A2780-DDP的细胞增殖无差异,见图1。

A：CCK-8检测细胞耐药性;B：RTCA方法检测A2780和A2780-DDP细胞增殖及耐药性差异。

2.2 耐药细胞迁移和侵袭能力提高

细胞划痕和Transwell实验结果显示,与A2780比较,A2780-DDP的细胞迁移和侵袭能力明显提高,见图2。

A：Transwell实验检测细胞侵袭能力,结晶紫染色观察;B：划痕实验检测细胞迁移能力,100×;a：P<0.05。

2.3 ITGB7/Akt通路在耐药细胞中存在着高表达和高活性

通过差异基因表达分析,选取了IGF1R、PIK3CG、PDGFRA 3个表达降低的基因及PDGFC、ITGB7、ITGA8 3个表达升高的基因进一步分析验证。通过设计合成定量PCR引物(表1),qPCR结果与RNA-Seq分析结果一致,A2780-DDP的ITGB7表达水平明显高于A2780;Western blot结果显示,与A2780比较,A2780-DDP的p-Akt蛋白表达水平升高,见图3。

表1 定量PCR引物序列

A：qPCR检测相关基因的表达水平;B：Western blot检测Akt和p-Akt蛋白的表达。

2.4 TPL等小分子药物可以有效拮抗DDP耐药

为找寻潜在DDP拮抗剂,通过文献查阅及CCK-8验证,发现TPL、奥拉帕尼等抑制剂对A2780-DDP具有较好的抑制效果,其中TPL的拮抗效果尤为明显,A2780-DDP的IC50约为0.17 μmol/L,与A2780差异明显,具有继续研究的价值,见图4。

A：5-氟尿嘧啶对细胞活力的影响;B：OTS964对细胞活力的影响;C：CPT对细胞活力的影响;D：AZD7648对细胞活力的影响;E：TPL对细胞活力的影响;F：奥拉帕尼对细胞活力的影响。

3 讨 论

DDP耐药是卵巢癌化学治疗中的常见阻碍之一,严重影响患者的治疗效果。因此,深入讨论卵巢癌DDP耐药的产生机制和关键因素,具有重要意义和价值。本研究基于转录组学方法,首次发现ITGB7/Akt通路在DDP耐药中存在高表达、高活性,并筛选出TPL等潜在的DDP耐药拮抗剂。

ITGB7/Akt在肿瘤的发生、发展等多个过程中发挥调控作用。ITGB7是整合素超家族的成员,主要与细胞黏附功能相关。整合素家族是ECM分子(如胶原蛋白Ⅳ)中的主要细胞表面受体。细胞膜上的整合素受体与ECM相互作用,传递信号以控制细胞生长、代谢、迁移、增殖、分化和其他行为和功能[10]。据报道,整合素的失调与癌症的发生和进展密切相关,可以用作癌症治疗的靶点[11-12]。整合素亚基基因(ITG)包含一系列α(ITGA1、ITGA10、ITGA11、ITGA2、ITGA2B、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、ITGA7、ITGA8、ITGA9、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV和ITGAX)和β(ITGB1、ITGB1BP1、ITGB1BP2、ITGB2、ITGB3、ITGB3BP、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、ITGB8和ITGBL1)基因。有研究表明,一些ITG基因与表观遗传变化相关,并在肿瘤进展和肿瘤治疗中发挥重要作用[16-19]。ITGB7在各种癌症中广泛表达,如胃癌和结肠癌,且可以通过维持抗肿瘤免疫来抑制结直肠癌发病[20]。

Akt是细胞中一个经典的信号通路,在细胞生存当中发挥着重要作用,在原发性乳腺癌中发现Akt信号通路被激活[21-23]。已经发现抑制Akt可能导致卵巢癌细胞生长停滞,这表明Akt在卵巢肿瘤的发展中发挥了作用[23-24]。本研究的Western blot结果证实,ITGB7的蛋白水平和p-Akt水平在DDP耐药细胞中明显提高,这表明ITGB7和Akt可能是DDP耐药发生的关键因素和可能的检测标志物,更为后续基于ITGB7/Akt通路的DDP耐药拮抗剂的开发和临床研究提供了重要数据支持。

针对DDP耐药,目前临床多应用DDP联合药物治疗成功地降低了药物毒性和肿瘤的耐药性。临床研究表明,在DDP治疗各种肿瘤的基础上加入5-氟尿嘧啶、紫杉醇、吉西他滨、阿霉素等都可获得良好的疗效或减少不良反应[25],需要更多的研究来提高抗癌活性,降低毒性和交叉耐药性或改善药理特性。为此,本研究基于CCK-8检测,筛选发现TPL、奥拉帕尼等对DDP耐药具有较好的抑制效果,但其拮抗机制仍有待进一步分析。

综上所述,本研究通过构建DDP耐药卵巢癌细胞株探讨了耐药后细胞转录组学的差异,并进行小分子药物筛选,为寻找DDP耐药的发生机制及治疗耐药的新方法。