全自动在线固相萃取-液质联用方法测定污水中11种常见毒品

吕建霞,蒋力维,杨 哲,王 晨,陈思梦,张 崇,孙小杰

(1.国家毒品实验室 北京分中心,北京 100164;2.SCIEX 中国技术支持中心,北京 100015)

毒品滥用已成为世界范围内不容忽视的问题。2021年中国毒情形势报告中指出全国共破获毒品犯罪案件5.4万起,抓获犯罪嫌疑人7.7万名,缴获毒品27 t,查处吸毒人员32.6万人次。在新冠疫情的影响下,吸毒人数减少[1-2],但毒品滥用种类多样,吸食毒品替代物质情况增多。滥用场所更加隐蔽,利用网络平台在线吸毒增多,发现查处难度大。监测毒品滥用情况可以及时掌握本地区毒品滥用的种类以及毒品消费量,而如何监测则成为一个新的课题。2001 年DAUGHTON[3]提出了一个新的概念——污水流行病学方法来评估毒品消费情况,其原理是通过测定污水处理厂进水中毒品及其代谢物浓度,通过污水厂日处理量、服务区域的人口数量及毒品排泄率等参数反算毒品滥用量。应用污水流行病学方法进行毒情监测,省时省力且客观性强,能为缉毒部门提供合理有效建议,目前已被很多国家应用于毒情监测[4-7]。

污水中毒品代谢物的浓度测定是污水分析法评估毒品滥用量的关键。方法的基础是对生活污水中的毒品及代谢物进行分析。毒品代谢物进入污水收集系统后与生活污水进行混合,其中代谢物含量被稀释上千甚至上万倍,浓度通常只有纳克甚至皮克级别,并且污水成分复杂,因此对污水样品进行富集净化的前处理方法非常重要。目前污水中毒品及其代谢物的前处理方法主要有液液萃取法[8-9]、针式微萃取技术[10]和固相萃取方法[11-14]。液液萃取耗费的试剂比较多,而且净化效果不理想;针式微萃取技术比较适合于气相色谱的热解析,在液相色谱中应用较少;而固相萃取由于其较高的回收率和优异的净化效果而应用比较广泛。离线固相萃取方式步骤比较繁琐,需要耗费大量的人力、物力、时间成本;相比传统的离线固相萃取方式,在线固相萃取(Online SPE)具有样品利用率高、所需样品少;全体积自动在线萃取、解吸、进样,通量高、可大大节约人力及时间成本;以及前处理交叉污染相对较少等特点,因此在实际污水验毒工作中深受一线检测人员欢迎。基于此,本工作开发了全自动On-line SPE-LC MS/MS 系统对污水中11种常见毒品及代谢物进行定性与定量分析方法,并用于污水中11种常见毒品及代谢物的定量测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

全自动样品前处理平台PAL3系统,瑞士CTC公司,超高效液相色谱-串联质谱联用仪(色谱仪:美国SCIEX Exion LC 20ADTM系统,质谱仪:美国SCIEX Triple QuadTM6500系统),固相萃取柱Oasis HLB(2.10 mm×30 mm,20 μm),美国Waters公司。

11种常测毒品的标准品(1 mg·mL-1,甲醇溶剂)和人口标记物可替宁以及各自相应的氘代内标储备液(100 μg·mL-1,甲醇溶剂),美国Cerilliant公司,包括苯丙胺(AM)、苯甲酰爱康宁(BZE)、氯胺酮(K)、甲基苯丙胺(MA)、3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)、去甲氯胺酮(NK)、O6-单乙酰吗啡(O6)、吗啡(Mor)、可卡因(Coc)、可待因(Cod)、可替宁(Cot),以 及 AM-D5、BZE-D3、K-D4、MA-D5、MDA-D5、MDMA-D5、NK-D4、O6-D3、Mor-D3、Coc-D3、Cod-D6、Cot-D3。

1.2 样品前处理平台

PAL3平台是一款具备自动样品前处理功能的平台,机械臂能够在X,Y,Z三维方向自由移动,能够实现自动加液、样品瓶转移、振荡混匀、大体积进样等功能。基于该平台,建立了全自动样品前处理方法,包括自动添加内标、将样品瓶转移至涡旋混合器中混匀、大体积上样至固相萃取小柱等步骤。

1.3 质谱和液相色谱参数的优化

质谱中需要优化的参数主要是去簇电压和碰撞能量,根据所检测化合物的相对分子质量设置扫描的质荷比的范围,寻找母离子。利用仪器自动优化去簇电压(DP)得到最佳母离子响应。然后再自动优化碰撞能量(CE),得到最佳响应的子离子对。丰度最大的离子对作为定量离子对,另一离子对作为定性离子对。

采用液相色谱柱Phenomenex Kinetex Biphenyl(2.1 mm ×100 mm,2.6 μm),优化流速、流动相pH 值、所含盐类及浓度、洗脱梯度等条件,以获得目标物的理想峰形和高分离度。

2 结果与讨论

2.1 优化后的样品前处理参数

从取样点取回的污水冷冻保存,进行测定前先解冻,然后经过0.45 μm 玻璃纤维滤膜过滤,取10 mL过滤后的样品于20 mL 样品瓶中,置于PAL3全自动样品前处理平台样品托盘中,待分析。启动样品前处理程序后,PAL3系统会自动使用进样针向样品中添加同位素内标制得25 ng·L-1的溶液,然后将样品瓶转移至涡旋混合器混合均匀,再将样品瓶转移回样品托盘上,待上样分析。

PAL3系统自动从样品瓶中采用定量环定量移取样品2 mL上SPE小柱进行富集净化。离线固相萃取的相关研究[12,14]中,均选择使用Oasis HLB(60 mg,3 mL),本方法中也选择相同类型的SPE小柱,以求取得好的实验结果,同时根据在线固相萃取小柱的要求选用不同的尺寸,因此本方法中使用的小柱类型为:Oasis HLB(2.1 mm ×30 mm,20 μm)。采用的流速为2 mL·min-1,流动相A:水;流动相B:甲醇,采用的梯度见表1。

表1 泵1流动相洗脱程序Table 1 Mobile phase elution procedure of pump 1

2.2 优化后的液相色谱参数

分析柱:Phenomenex Kinetex Biphenyl(2.1 mm ×100 mm,2.6 μm),具有100%水溶性溶剂稳定的反相固定相,具备疏水性选择性、芳香族选择性和增强的极性选择性,能够保证所有化合物具有良好的峰形和分离度。流动相中有机相选用乙腈,乙腈具有中等洗脱能力、强溶解能力、能够得到明确的色谱峰、低黏度等特性,比较适合用作流动相。流动相中加入适量的甲酸和甲酸铵,可以调节流动相的pH 值,也可以提高目标物的电离效率。具体参数如下,柱温:40 ℃,流动相A:水(0.02%甲酸+2 mmol·L-1甲 酸铵);B:乙腈(0.02% 甲酸+2 mmol·L-1甲酸铵),流速0.4 mL·min-1,梯度见表2。

2.3 优化后的质谱检测参数

电喷雾电离源,正离子化模式(ESI+);监测方式:多反应监测(MRM);电喷雾电压(IS):3 000 V;气帘气压力(CUR):30 Psi(1 Psi=6.89 kPa);碰撞气压力(CAD):8 Psi;雾化气压力(GSI):55 Psi;辅助加热气压力(GS2):65 Psi;辅助气温度:500 ℃。每个化合物的离子对、去簇电压、碰撞能量见表3。

表3 12种目标物及其内标的质谱参数Table 3 MS parameters of 12 objectives and internal standards

2.4 对已优化的方法的评价

2.4.1 12种目标物的典型色谱图

可替宁是尼古丁的代谢物,吸烟人群排出体外到污水中,而可替宁只有人体代谢这一来源,因此可做为一种生物标记物,来计算采样区域服务人口数量。所以除了11种常见毒品之外,可替宁也作为一种目标物需要进行测定。

配制12种目标物的混合标准溶液,浓度为20 ng·L-1,直接进样,考察各目标物的出峰情况,见图1。如图1所示,12种目标物的出峰时间在4.4和7.0 min区间内,每个化合物的峰形良好,充分表明本方法用于检测此12种物质完全可行。

图1 12种目标物的典型色谱图Fig.1 Representative chromatogram of 12 objectives

2.4.2 标准曲线及灵敏度结果

采用空白污水基质样本加标,配置浓度在1～500 ng·L-1范围内的系列标准曲线,内标加入浓度为25 ng·L-1,以目标物峰面积与内标峰面积比值为纵坐标,浓度为横坐标,做线性关系图。全部12种化合物线性关系良好,线性方程和相关系数见表4。

表4 12种目标物的线性方程及定量限结果Table 4 Linearity and LOQ of 12 objectives

将1 ng·L-1的标准品溶液逐级用水稀释,以信噪比S/N≥10为定量限标准,确定12种化合物的仪器灵敏度(见表4)。

2.4.3 重复性及回收率结果

针对本方法中涉及的12 种化合物,在1、10、100 ng·L-13个浓度下进行加标回收试验,污水的实际加标回收率在87.7%～113.8%之间,满足方法学要求。同时进行3个浓度点的重复性试验,所有化合物浓度的相对标准偏差RSD 在1.49%～7.39%之间(表5),方法及仪器的稳定性良好。

3 方法应用于实际污水样品的检测

分别在2个污水处理厂采集了4份污水样品,编号为:589、602、617和572,经PAL3全自动样品前处理平台进行自动加内标混匀后,大体积进样到液相色谱中,在线固相萃取富集净化后上机检测,测定结果见表6。从结果中可以看出,检出的毒品种类主要有吗啡、甲基苯丙胺、3,4-亚甲基二氧基苯丙胺、氯胺酮,检出的浓度分别为2.13～7.82 ng·L-1、0.16 ng·L-1、0.27～1.70 ng·L-1、0.21～0.44 ng·L-1;吗啡检测含量较高,可以为相关部门的毒情研判提供一定的线索。实际样品的检测谱图,见图2。

表6 实际污水样品测定结果Table 6 Determination results of actual sewage samples

4 结论

采用SPE小柱富集净化,液相色谱串联质谱仪检测,建立了全自动On-line SPE-LC-MS/MS联用方法测定污水中11种常见毒品及代谢物的分析方法。本方法不仅可对污水样品实现全自动样品前处理操作,而且灵敏度高,具有绿色环保、准确可靠的优点,适用于实际污水样品中常见毒品的测定,能够为毒情监测工作提供强有力的技术支撑。