液相色谱-串联质谱法同时测定污水中10种精神活性物质

蒋力维,霍雨萌,吴一荻,杨 哲,余 磊,孙小杰,吕建霞

1.国家毒品实验室北京分中心,北京 100164

2.SCIEX公司中国亚太应用支持中心,上海 200050

精神活性物质是一类摄入人体后会对人体中枢神经系统产生强烈精神药理作用的化合物,具有易成瘾性。滥用精神活性物质可导致幻听、妄想等多种神经行为障碍。精神活性物质与抗生素等其他药物一样[1-2],主要是通过与其生产、消费等有关的人类活动进入环境。环境中常见的精神活性物质主要包括甲基苯丙胺、苯丙胺、氯胺酮、美沙酮和海洛因等[3-5]。精神活性物质进入生物体后不能被完全代谢,未被代谢的母体化合物或代谢产物可经尿液或粪便等排泄物进入污水系统[6]。我国污水处理厂主要采用的污水处理工艺目前还无法完全除去污水中的精神活性物质及其代谢物。未被去除的精神活性物质会随污水进入自然水体,甚至污染饮用水,对公众健康和水生生态系统健康造成潜在危害[7]。精神活性物质可调节生物体的中枢神经系统,导致暴露于环境中的生物体的行为(如昼夜节律、进食速度、社会特征等)发生改变[8-9]。水生生物体若长期处于低浓度精神活性物质环境中,可能会表现出慢性中毒现象。除此之外,水环境中存在的工业中间体、农药残留、治疗药物、多环芳烃等有机污染物及重金属可能会进一步引发相加或协同作用,从而对水生生物产生更大的毒性[10-11]。自然界中的各类生物的生存都离不开水,因而所有生物都有可能会受到水环境中的精神活性物质的直接或间接影响。综上,精神活性物质可被视为一类新型环境污染物。

开展水环境精神活性物质研究不仅有利于完善环境监测与生态安全评价体系,而且可在一定程度上为区域禁毒工作提供精准线索,在预防和打击毒品犯罪等方面发挥积极作用。因此,开发简单、快速、高效的水环境精神活性物质检测方法具有重要的现实意义。截至目前,相关国家和地区针对水环境精神活性物质检测技术已开展了大量研究,其中气相色谱-质谱串联法(GC-MS/MS)[12-13]与液相色谱-质谱串联法(LC-MS/MS)[14-16]是较为常用的检测技术。GC-MS/MS可对多种精神活性物质同时进行定性和定量分析,但由于水样中的大多数化合物的极性太强或挥发性较差,故需要对分析物进行衍生化反应。然而,衍生过程烦琐,往往需花费大量时间,并可能引发副反应,进而产生一系列干扰物。LC-MS/MS不仅具有较高的灵敏度和选择性,而且无需对样品进行衍生化处理,分析过程操作简便,能用于热稳定性、低挥发性、高极性化合物的测定,因而其在精神活性物质检测方面的应用最为广泛[17-20]。

由于水环境中精神活性物质的浓度极低,仅为ng/L级别,故常需对样品进行液相萃取(LLE)或固相萃取(SPE)后才能进样分析[21-24],但此过程需要耗费大量的时间与材料。本实验基于具有高灵敏度的质谱系统,探索不经前处理富集而直接进样的方式,针对水中10种精神活性物质开发了一套简单、快速的LC-MS/MS方法。同时,通过将本方法检测结果与在线和离线SPE-LC-MS/MS检测结果进行对比,验证本方法的准确性和有效性,以更好地应用于实际污水样品分析。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

液相色谱仪-质谱联用仪(美国SCIEX,Triple Quad 7500),超纯水发生器(美国Millipore,Milli-Q Reference),超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,KQ-500E)。甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵(色谱纯)均购自美国Thermo Scientific公司。10种标准物质溶液(1.0 mg/mL,纯度>99%)以及相应的氘代内标物溶液(100 μg/mL,纯度>99%)购于美国Sigma-Aldrich公司,具体信息见表1。

表1 精神活性物质及其氘代内标物基本信息

1.2 标准溶液配制

混合标准工作溶液：分别移取浓度为1.0 mg/mL的吗啡、苯丙胺和甲基苯丙胺等10种单一标准物质溶液,用甲醇配制成浓度为250 μg/L的混合标准物质工作溶液,密封并0～4 ℃保存。

混合氘代内标工作溶液：分别移取浓度为100 μg/mL的吗啡、苯丙胺和甲基苯丙胺等10种单一标准内标物溶液,用甲醇配制成浓度为12.5 μg/L的混合内标物质工作溶液,密封并0～4 ℃保存。

1.3 测定方法

1.3.1 质谱条件

电喷雾电离源(ESI)：正离子模式(+);监测方式：多反应监测(MRM);电喷雾电压(IS)：1 500 V;气帘气压力(CUR)：32 psi(1 psi=6.895 kPa);碰撞气压力(CAD)：9 psi;雾化气压力(GS1)：40 psi;辅助加热气压力(GS2)：70 psi;辅助气温度：500 ℃。各化合物的具体质谱参数见表2。

表2 10种精神活性物质及其内标物的质谱参数

1.3.2 色谱条件

研究组:该组患者在参照组治疗基础上与消化内镜联合使用,首先对患者胃脏内出血位置予以明确,之后利用氯化钠注射液冲洗出血位置。待充分显露后予以凝血酶和去甲肾上腺素冷进行止血。患者完成手术后需告知禁食,时间为2天。

选用Kinetex Biphenyl色谱柱(美国Phenomenex,100 mm×3.0 mm,2.6 μm),柱温为35 ℃,流动相A为1 mmol/L甲酸铵-0.01%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,流速为0.4 mL/min,进样量为20 μL。梯度洗脱程序：0～1.0 min,5%B;1.0～2.0 min,5%B～40%B;2.0～3.0 min,40%B～90%B;3.0～6.0 min,90%B～95%B;6.0～7.0 min,95%B;7.0～7.1 min,95%B～5%B。

1.4 样品采集和保存

使用玻璃瓶收集24 h混合水样500 mL,酸化到pH为2并冷藏(4 ℃)。如果样品不能酸化,建议在进行样品处理前将其于-20 ℃条件下冷冻保存,并在一周内完成相关前处理[25]。

1.5 样品前处理

取10 mL污水,加入100 μL一定浓度的甲酸铵与甲酸缓冲溶液,使污水中甲酸铵的最终浓度为1 mmol/L,甲酸含量为0.01%。加入20 μL浓度为12.5 μg/L的混合氘代内标,使内标物的最终浓度为25 ng/L。样品经离心后,过0.22 μm滤膜,待LC-MS/MS进样分析。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

由于目标物均有含氮的碱性基团,所以选用正离子模式电喷雾离子源。在质荷比(m/z)为100～350的范围内进行母离子扫描,找到每种分析物的稳定准分子离子([M+H]+)峰,然后分别以得到的分子离子作为母离子进行子离子扫描分析,选择两对最佳子离子作为定量与定性子离子。通过优化碰撞能量等参数,确保每种化合物的特征碎片离子对的效果达到最好。优化后的质谱条件见表2。

2.2 色谱条件优化

色谱柱类型对分析物的分离度、对称性、保留时间及响应值有关键影响。Kinetex Biphenyl色谱柱利用核-壳技术,在硅胶表面修饰具有芳香族选择性的基团,具备疏水性选择性、芳香族选择性和增强的极性选择性等,可以为本实验中的10种目标物质提供较好的分离效果。

2.2.1 流动相的选择

当使用水和甲醇为流动相时,部分物质的峰形并不理想。实验考察了甲酸、甲酸铵等添加剂对色谱分离效果及灵敏度的影响,发现在流动相中加入甲酸与甲酸铵后,不仅各物质的拖尾现象能得到明显改善,而且响应也显著增强。出现该情况一方面是由于甲酸与甲酸铵组成的缓冲体系可使各化合物的电离状态保持一致,从而改善具有含氮碱性基团的目标物的峰形;另一方面则是由于甲酸能够在正离子模式下提供H+,从而提高各物质的离子化效率。考虑到使用乙腈为有机相时的系统压力比使用甲醇时小,本实验最终采用含1 mmol/L甲酸铵-0.01%甲酸的水溶液与乙腈为流动相。通过优化梯度洗脱程序,10种目标物在10 min内即可完成快速分离。优化条件下的提取离子流色谱图见图1。

图1 10种精神活性物质的多反应监测模式色谱图

2.2.2 进样量的选择

进样量在一定程度上会影响方法的灵敏度和准确度。当进样量过多时,易使样品过载,超过线性范围,影响物质定量,严重时会造成色谱柱或检测器污染;但进样量太少时,又会使低含量的组分因检测器灵敏度不够而无法出峰。在优化好的LC-MS/MS条件下,实验考察了不同进样量对低浓度样品(1 ng/L)信噪比的影响。由表3可知,随着进样量的增加,各物质的信噪比逐渐增大。当进样量增至20 μL时,各物质的信噪比均大于10,能满足定量要求。综合考虑进样量对样品检测结果的影响,选择20 μL的进样量较为合适。

表3 进样量对灵敏度的影响

2.3 样品pH的影响

有机物的存在形态受溶液pH影响较大,不同的pH可能会使本实验所考察的10种具有含氮碱性基团的精神活性物质发生不同程度的电离。当溶液pH小于有机物pKa2个pH单位时,碱性有机物主要以离子形态存在;当溶液pH大于有机物pKa2个pH单位时,碱性有机物主要以分子形态存在。考虑到不同来源的环境水样的pH变化范围较大,因此,为了确保方法的准确度与重现性,本研究选择在水样中加入与流动相一致的甲酸-甲酸铵缓冲液,以维持样品的酸碱度,从而进行测定分析。

2.4 方法评价

2.4.1 基质效应

由于污水的组成复杂,某些干扰成分可能会与分析物共流出,影响电喷雾效率,从而导致强烈的基质效应,影响分析结果的准确性。选取某地区实际生活污水作为基质效应的供试水样,加入一定浓度的混合标准样品溶液,采用相对响应值法评价基质效应,即基质效应值=(目标物在基质中的响应值/目标物在纯水中的响应值)×100%。基质效应值大于1表示基质对信号有增强作用,小于1则表明基质对信号有抑制作用,越接近1表明基质效应越微弱[26]。由图2可知,10种精神活性物质的基质效应值均处于40%～80%之间,即存在一定程度的抑制效应。因此,为克服基质效应,本实验采用同位素内标法定量。

图2 基质效应考察结果

2.4.2 回归方程、相关系数、检出限及定量限

向纯水中加入不同体积的混合标准溶液、固定体积的混合氘代内标工作溶液(20 μL)及甲酸铵与甲酸缓冲溶液(100 μL),得到浓度范围为1～250 ng/L的系列混合工作溶液,用于定量分析。表4显示,10种目标物在1～250 ng/L线性范围内的线性关系良好,相关系数均在0.992以上。分别以信噪比为3和10时对应的浓度计算检出限与定量限,各物质的检出限和定量限分别低于0.15 ng/L和0.5 ng/L,表明该方法的灵敏度较高。

2.4.3 准确度及精密度

选取某地区实际生活污水(未检出目标物),分别加入不同体积的混合标准溶液和20 μL混合氘代内标工作溶液,在1、10、100 ng/L 3个浓度点平行测定3次,进行加标回收率测试和精密度试验。由表5可知,所有分析物的加标回收率均在87.2%～114%之间,相对标准偏差在0.53%～3.60%之间,表明本方法准确、可靠,完全能够满足污水中吗啡、甲基苯丙胺、苯丙胺等10种精神活性物质的检测要求。

表5 10种精神活性物质在不同浓度点下的回收率与相对标准偏差(n=3)

2.5 与常用SPE法的比较

分别考察了采用直接进样法和SPE法时,污水中精神活性物质的加标回收率(10 ng/L)。HLB柱是亲水亲脂反相SPE柱,采用多聚相二乙烯苯结合极性物质(如N-乙烯吡咯烷酮)为填料,对极性物质有一定的保留效果。MCX柱是强阳离子交换SPE柱,采用水可浸润性聚合物为吸附剂,对碱性化合物具有较高的选择性和灵敏度。这两种小柱是精神活性物质前处理中最常采用的SPE柱。本实验将在线SPE法(美国Waters,Oasis HLB柱)、离线SPE法(美国Waters,Oasis MCX柱)和直接进样法3种前处理方法进行了比较。其中,在线SPE法所需水样量为10 mL,完成检测所需总时长约为25 min,而离线SPE法所需水样量为50 mL,完成检测所需总时长约为80 min。

图3比较了3种前处理方法的回收率数据。研究结果表明,直接进样法的回收率处于90.8%～114%之间,SPE法的回收率则处于80.9%～115%之间。总体来说,直接进样法的回收率略优于SPE法。这不仅是因为受到了SPE柱自身吸附性质的影响,而且由于直接进样法不需要对SPE柱进行活化、上样、洗脱等处理,前处理过程少,从而使目标化合物的损失更少。相比于SPE法,直接进样法所需的样品量、有机溶剂量和耗材量更少,更符合经济节约的要求,并且其前处理过程简单,能将分析时长控制在10 min以内。因此,该方法有望应用于大批量水环境样品中精神活性物质的快速测定。

图3 采用不同前处理方法的10种精神活性物质回收率的比较

2.6 实际样品分析

采用上述直接进样-LC-MS/MS方法,对从某地区随机抽取的10份生活污水进行10种精神活性物质检测分析。结果显示,3份水样中检出了精神活性物质,其余水样中均未检出,具体检测结果见表6。

表6 10种精神活性物质的实际样品分析结果

此外,在检出精神活性物质的3份水样中,主要检出物有吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮,检出的浓度范围分别为3.41～9.55、0.90～1.63、1.06～1.78 ng/L。由表6可知,吗啡的含量稍高,说明该地区吗啡的使用量较大,吗啡是该地区涉及的主要精神活性类药物种类。这也符合我国的实际情况[27]。

3 结论

采用内标法定量,建立了直接进样检测水体中10种精神活性物质的LC-MS/MS方法。实验结果显示,本方法可在10 min内完成一次样品分析,实际样品的加标回收率为87.2%～114%,相对标准偏差为0.53%～3.60%,检出限为0.05～0.14 ng/L,定量限为0.16～0.46 ng/L。本方法在前处理操作步骤和分析时长等方面具有显著的优势,能满足大批量实际污水样品的快速检测要求。开展污水中精神活性物质的常态化监测,不仅有利于完善环境监测与生态安全评价,而且能及时掌握区域内的毒情变化趋势,有效推动毒品案件的侦办,为区域禁毒工作提供靶向性指引,更好地服务于禁毒实战。