夹脊电针通过抑制Xc-/GPX4通路促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复

栾逸先,尹洪娜,朱荟一,田洪昭,张文钊,应雨校,李禹洋,李 全△

1.海南省中医院,海南 海口 570100;2.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001;3.海口市琼山区云龙镇卫生院,海南 海口 570100;4.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)作为常见的、严重的中枢神经系统损伤,多造成受损脊髓节段以下所支配部位运动功能和感觉功能障碍,对患者的日常生活造成严重影响,对患者及家庭、社会产生极大负担[1]。SCI分为原发性损伤与继发性损伤,原发性损伤后,脊髓微环境失衡,大量神经元死亡,产生继发性损伤[2]。研究证实,中枢神经系统创伤后导致的细胞死亡是神经功能丧失的主要原因,干预细胞死亡可以有效地减轻继发性损伤,促进SCI恢复[3]。在SCI中发现的细胞程序性死亡主要有凋亡、自噬、焦亡、坏死性凋亡和铁死亡。其中,铁死亡(Ferroptosis)是一种重要的细胞死亡方式,是一种铁离子依赖的脂质过氧化损伤引起的非凋亡程序性死亡途径[4]。随着对铁死亡认识的加深,其在中枢神经系统退行性变与创伤性损伤中的重要作用也被逐渐发现[5]。研究表明,SCI急性期局部出血导致损伤区域铁离子含量迅速升高,增加活性氧与4-羟基壬烯酸积聚,过量的铁离子聚集引发铁死亡发生[6-7]。铁死亡是继发性SCI神经细胞死亡的主要机制,可以通过调控Xc-/GPX4通路抑制铁死亡Xc-/谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)通路促进SCI的修复[8]。铁死亡受 GPX4-GSH-半胱氨酸轴调节,主要通过系统Xc-摄取胱氨酸,减少GPX4将磷脂氢过氧化物加工成脂醇、GSH合成以及减少胱氨酸向半胱氨酸的转化[8]。临床试验中已证实夹脊电针治疗SCI有显著疗效,对SCI后神经系统组织功能恢复具有明显作用[9]。研究表明,夹脊电针可以减轻脊髓损伤大鼠脊髓神经元细胞中脂质过氧化,修复受损脊髓组织[10]。铁死亡在SCI中起到重要作用[11],那么夹脊电针能否通过调控Xc-/GPX4通路减少ROS过载从而抑制铁死亡修复SCI值得进一步探讨。

因此,本研究主要观察夹脊电针对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复,检测夹脊电针对铁死亡关键因子GSH、GPX4表达,明确夹脊电针对铁死亡通路的影响,为临床运用针灸治疗脊髓损伤提供新的思路和分子生物学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

72只健康清洁级雄性Sprague Dawley大鼠由黑龙江中医药大学实验动物中心提供,体质量220～250 g,于黑龙江中医药大学针灸临床神经生物学重点实验室动物房进行分笼饲养,每笼4只,室温(20±2)℃,相对湿度25%～75%,12 h光照/黑暗循环,自由进食饮水,每日更换垫料,适应性喂养7 d。动物使用和护理规程符合国家卫生研究院制定的《实验动物使用和护理指南》。实验经海南省中医院实验动物管理与使用委员会审批(批号:IACUC-HPHCM-231200)。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 试剂 GPX4 RabbitPolyClonal antibody (美国proteintech);beta-Actin Mouse MonoClonal antibody(美国proteintech);HRP-Goat-Anti-Rabbit IgG(H+L)(美国proteintech);HRP-Goat-Anti-Mouse IgG(H+L) (美国proteintech);GSH检测试剂盒(中国索莱宝);甲苯胺蓝(中国Biosharp);伊红染色液(中国Biotopped);Harris染色液(中国Biotopped)。

1.2.2 仪器 Impactor M-Ⅲ型脊髓打击器(美国NYU);Micro Plus型脉冲电针仪(美国);0.30 mm×13 mm无菌针灸针(吴江市云龙医疗器械有限公司);Centrifuge 5418高速离心机(德国eppendorf);Primo Star普通光学显微镜(德国ZEISS);NanoQuant infinite M200PRO多功能酶标仪(瑞士TECAN);Centrifuge 5418高速离心机(德国eppendorf);miniPRO4迷你垂直电泳仪(北京WIX);ChemiDoc MP化学发光成像系统(美国BIO-RAD);HZQ-F100振荡培养箱(北京海天友诚科技有限公司);ChemiDoc MP化学发光成像系统(美国BIO-RAD)。

1.3 动物分组

72只大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(SCI)、夹脊电针组(EA)和抑制剂(Fer-1)4组,每组18只,再将每组按照不同的治疗时间分为3 d组、7 d组与14 d组3个亚组,每亚组6只。

1.4 模型制备

使用ALLEN’s方法制备脊髓损伤大鼠模型[12]:大鼠于手术前10 h禁食禁水,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.03 mL/10 g),俯卧位固定躯干及四肢。手术局部脱毛备皮,进行规范消毒处理后加铺无菌手术巾。以第10胸椎(T10)节段为中心(背部棘突手触及圆钝点处)沿脊柱后正中线做纵向切口,钝性剥离肌肉,切除T10椎板,充分暴露T10对应脊髓。使用NYU Impactor M-Ⅲ打击器进行脊髓损伤:一根重10 g(底部直径2.5 mm)的冲击棒,落差为50 mm,损伤能量为50 g·cm,造成相对严重损伤。其造模成功的标志为:当打击棒接触到脊髓时,与探针形成闭合回路提示音,打击后可见损伤节段脊髓立即出现血肿,大鼠出现左右甩尾现象伴双下肢的抽搐,随后鼠尾完全下垂,无自主运动。同时软件提示无错误,电脑记录撞击过程呈抛物线。打击成功后在损伤节段外侧皮肤进行标记,以备针刺干预,生理盐水清洗并在缝合处使用抗生素(阿莫西林)预防感染[13]。术后每只鼠单独饲养,保温至大鼠苏醒。每天辅助排尿,早晚各1次直至排尿功能恢复,按摩大鼠腹部,防止胃胀气和排便困难。

假手术组大鼠仅进行椎板切除,不进行脊髓打击。

1.5 干预方法

电针组(EA):损伤后进行夹脊电针治疗[14],操作方法:选取损伤区(造模标记处)上、下棘突节段旁开7 mm(竖脊肌处)以内处,左右分别取穴。常规消毒后用毫针刺入,针尖指向脊柱,使针尖触及椎板。针刺成功后使用Micro Plus型脉冲电针仪,正极连接上端针柄,负极连接同侧下端针柄,双侧相同处理。电针选取参数:①脉冲波型:连续脉冲波形;②脉冲重复频率:100 Hz;③电流输出强度:以背部肌肉出现轻微抽动为度(约1 mA)。持续30 min,1次/d。

抑制剂组(Fer-1):损伤后进行药物干预[15],将抑制剂铁抑素-1(Fer-1)溶于DMSO溶液配成浓度1 mmol/L,再用生理盐水稀释1 000倍制成抑制剂注射液,该配比后抑制剂按大鼠体质量克数×0.001进行腹腔注射。

假手术组与模型组进行同样方法固定,30 min/次,1次/d,无治疗干预。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分 对脊髓损伤大鼠的后肢功能恢复情况进行评价[16]。量表评分范围从0分(完全瘫痪)到21分(正常),用于评估关节运动、步态和后肢的协调以及脚趾的精细运动,分数越高代表运动功能越好。各组大鼠按照脊髓损伤3 d、7 d和14 d进行动态评估,将大鼠放于开放视野场地自由移动5 min,由两名不清楚大鼠分组的研究人员采用盲法进行评分,取平均值进行计算。

1.6.2 斜板实验 手术前及干预3 d、7 d和14 d对各组大鼠进行斜板测试,将大鼠置于斜道上记录大鼠能够停留5 s的最大角度,每只大鼠测量3次取平均值[17]。

1.6.3 HE染色 观察脊髓病理变化。取制备好的石蜡依次进行切片、脱蜡和水化,苏木溶液浸泡10 min,流水冲洗1 min,氨水反蓝,伊红染色1 min,蒸馏水漂洗、酒精逐级脱水(85%乙醇-1 s、95%乙醇-3 s、100%乙醇-1 min和100%乙醇-1 min)、二甲苯透明化、中性树脂封片和镜检,于光学显微镜(200×)拍照,观察脊髓病理变化与细胞[18]。

1.6.4 Nissl染色 观察脊髓前角运动神经元数量。取已制备好的1/3石蜡切片进行脱蜡、水化,置于60 ℃温箱中1%甲苯胺蓝溶液(储备液:0.5 g甲苯胺蓝+100 mL无水乙醇;工作液:50 mL储备液+50 mL生理盐水)染色1 h,氯水及95%乙醇分化后脱水、透明和中性树脂封片。于光学显微镜(200×)拍照,观察染色效果并进行细胞计数[18]。

1.6.5 Western blot检测 检测损伤脊髓组织中GPX4蛋白的表达[19]:造模后3 d、7 d与14 d,大鼠用10%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉处死。在冰袋上迅速取下损伤脊髓(距损伤中心1 cm),生理盐水冲洗后放入标记好的冻存管中,放进-80 °冰箱中待用。检测时称量、裂解、匀浆与离心后提取总蛋白处理样品。利用酶标仪使用BCA法测得蛋白浓度,煮沸冷却后留出一半样本应用ELISA检测,其他样本加入上样缓冲液稀释使各样品浓度相同,制得蛋白样品;SDS-PAGE凝胶(根据目的蛋白的分子量选取10%和15%的分离胶,5%的浓缩胶)电泳后转膜至PVDF膜,1%PBST漂洗2×5 min后5%奶粉室温封闭1 h;分别加入蛋白抗体:GPX4(稀释比例1∶5 000)后4 ℃过夜;复温30 min后1%PBST漂洗3×10 min,加入羊抗兔IgG-HRP(稀释比例1∶5 000),二抗37 ℃孵育45 min;1%PBST漂洗3×10 min后暗室滴加ECL发光液,使用IMAGE STUDIO成像系统选择自动曝光时间后采集图像;应用Image Lab 5.2.1软件分析条带灰度值,以蛋白的灰度值/内参(β-Actin)的灰度值为相对表达量[19]。

1.6.6 ELISA检测 将蛋白样品按照质量体积比=1∶1加入1倍已配置好的PBS液,匀浆后转移至离心管中,加入9倍PBS液,震荡,5 000 r/min离心10 min,取液。按照ELISA试剂盒说明书操作后,使用酶标仪选择450 nm波长测量各孔吸光度,根据样品吸光度确定大鼠脊髓组织GSH的表达含量[19]。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠BBB评分比较

各组大鼠BBB评分,SCI后3 d、7 d和14 d,SCI组BBB评分与Sham组比较明显降低(P<0.01);EA组、Fer-1组BBB评分与SCI组比较明显增加(P<0.01);EA组BBB评分与Fer-1组比较,在3 d、7 d差异无统计学意义(P>0.05),在14 d有显著增加(P<0.05)。夹脊电针与抑制剂均能改善SCI后大鼠后肢运动功能,14 d后,夹脊电针的疗效优于抑制剂。见表1。

表1 各组大鼠BBB评分

2.2 各组大鼠斜板实验比较

各组大鼠斜板角度,术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。SCI后3 d、7 d与14 d,SCI组斜板角度与Sham组比较明显降低(P<0.01);EA组、Fer-1组斜板角度与SCI组比较明显增加(P<0.01);EA组斜板角度与Fer-1组比较,在3 d、7 d差异无统计学意义(P>0.05),在14 d差异有统计学意义(P<0.05)。夹脊电针与抑制剂均能改善SCI后大鼠后肢功能,14 d后,夹脊电针的疗效优于抑制剂。见表2。

表2 各组大鼠斜板测试

2.3 各组大鼠脊髓损伤部位病理形态学及前角运动神经元数目的比较

2.3.1 HE染色结果 HE染色观察各组大鼠脊髓组织病理形态学变化,Sham组脊髓组织结构完整清晰,灰质与白质界限清晰,神经纤维排列规整,神经细胞形态正常且分布均匀,细胞基质较均匀有少许的红细胞。而SCI组、EA组和Fer-1组脊髓组织结构紊乱,排列松散,神经元死亡。脊髓损伤3 d时间点SCI组具有明显的病理学改变,灰质结构紊乱,与白质界限不清,神经元大量丢失,剩余神经元肿胀严重,大量炎性细胞浸润(以中性粒细胞与单核细胞为主),明显的片状出血灶,而EA组、Fer-1组相对SCI组比较神经元丢失较少。脊髓损伤7 d、14 d时间点SCI组灰质神经元丢失仍然明显。出血性病灶相对3 d减少,而EA组、Fer-1组灰质结构较完整,神经纤维排列较规整,神经元数量较多,空洞较少,炎性细胞浸润得到改善。见图1。

图1 各组大鼠脊髓组织HE染色(200×)

2.3.2 Nissl染色结果 各组大鼠前角运动神经元,Sham组前角运动神经元排列规整,无明显减少,细胞呈深蓝染色;SCI组、EA和Fer-1组前角运动神经元数量明显减少,染色相对较浅。在3 d、7 d和14 d时间点,SCI组与Sham组前角运动神经元数量比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。SCI后3 d时间点,SCI组前角运动神经元残存数量显著减少,而EA组、Fer-1组前角运动神经元残存数量虽然减少,但相对于SCI组较多,染色相对较深,两组比较有统计学意义(P<0.01);EA组与Fer-1组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。SCI后7 d 时间点,SCI组前角运动神经元残存数量显著减少,而EA组、Fer-1组前角运动神经元残存数量虽然减少,但相对于SCI组较多,染色相对较深,两组比较有统计学意义(P<0.01);EA组与Fer-1组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。SCI后14 d时间点,SCI组前角运动神经元残存数量显著减少,而EA组、Fer-1组前角运动神经元残存数量虽然减少,但相对于SCI组较多,染色相对较深,两组比较差异有统计学意义(P<0.01);EA组与Fer-1组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图2。

图2 各组大鼠脊髓前角运动神经元残存比较(200×)

表3 各组大鼠前角运动神经元数量

2.4 各组大鼠脊髓组织中GPX4蛋白表达量比较

各组大鼠GPX4表达量,SCI后3 d、7 d与14 d,SCI组GPX4的表达与Sham组比较明显降低(P<0.01);EA组、Fer-1组GPX4的表达与SCI组比较明显增加(P<0.01);EA组3 d与SCI组间比较差异无统计学意义(P>0.05);EA组GPX4的表达与Fer-1组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图3。

图3 各组大鼠脊髓组织中GPX4蛋白表达量比较

表4 各组大鼠GPX4表达量

2.5 各组大鼠脊髓组织中GSH水平比较

各组大鼠GSH表达量,SCI后3 d、7 d与14 d,SCI组与Sham组比较明显降低(P<0.01);EA组、Fer-1组GSH的表达与SCI组比较明显增加(P<0.01);EA组GSH的表达与Fer-1组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 各组大鼠GSH表达量

3 讨论

越来越多的证据表明夹脊电针能够有效促进脊髓损伤修复[19-21]。夹脊电针通过在脊髓损伤部位施加电刺激来促进神经再生和功能恢复。研究表明,夹脊电针可以改善脊髓损伤患者的运动功能、感觉功能和自主神经功能[22]。夹脊电针源于中医古籍中的“夹脊疗法”,被认为具有疏通经络、活血化瘀和统一阴阳等作用[22]。《针灸大成》中记载,夹脊电针能够刺激脊髓损伤部位的经络和穴位,从而恢复气血运行、激发脊髓自愈能力[23]。现代研究发现,在脊髓损伤中,夹脊电针通过多方面发挥作用。电针通过对脊髓损伤区域施加适当的电刺激,可以改善神经细胞的兴奋性,促进神经再生和修复[24]。夹脊电针可以促使神经细胞产生和释放神经营养因子,如脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF),这些因子对于神经再生和功能恢复具有重要作用[25]。夹脊电针可以调节炎症反应,减轻脊髓损伤部位的炎症反应,促进组织修复和再生[26]。

本研究结果表明,脊髓损伤后,大鼠后肢运动功能严重受损,受损区域脊髓组织中神经组织受损严重,GSH水平及GPX4表达均减少。经夹脊电针治疗后,大鼠后肢运动功能明显改善,脊髓受损区域GSH水平及GPX4表达量升高,与铁死亡通路抑制剂Fer-1所产生的效果一致,说明夹脊电针具有通过抑制铁死亡的发生减少神经元细胞受损、阻止神经纤维脱髓鞘发生、促进神经细胞恢复和促进大鼠运动功能恢复的作用。

脊髓损伤后,局部区域即刻发生充血肿胀,继而出现氧化应激、炎症细胞浸润及神经细胞损伤,同时出现损伤节段以下感觉、运动及二便障碍[27]。为了降低二便障碍对运动功能恢复的影响,同时降低大鼠死亡率,本研究中大鼠脊髓损伤打击损伤点为第10胸椎,因大鼠交感神经位于L1～2,副交感神经和躯体神经位于L6～S1,T10损伤大鼠模型可保留膀胱功能的低级神经控制,减少造模后尿潴留概率,提高大鼠存活率[28]。脊髓损伤后髓内出血明显,神经元变性、死亡,同时灰质白质结构紊乱、边界模糊消失[26]。由于RNA及相关酶数量增加,处于再生状态的神经元染色质发生裂解和细胞质体积增大,RNA由大颗粒转变为亚显微颗粒导致尼氏小体明显减少[27]。夹脊电针能够改善脊髓损伤后受损节段神经元形态与功能,维持局部结构稳定或促进紊乱结构的重塑,并且能够明显提高脊髓损伤后大鼠BBB评分[19]。本研究中观察到的病理变化及电针干预作用与既往报道相一致,再次证明夹脊电针能够有效改善脊髓损。

随着对铁死亡的研究深入,其作用机制和发生特点被逐渐阐明。研究表明Xc-/GPX4通路是铁死亡主要的发生途径之一[29]。GSH和GPX4为铁死亡负相关标志物,也是验证铁死亡的标志性因子[30]。SCI急性期导致局部出血后,损伤区域的铁离子含量显著升高,形成铁过载后,过量的铁和二价亚铁离子(Fe2+)能够与有机过氧化物ROOH或游离过氧化氢反应,生成可溶性脂烷氧基或羟基自由基[31],增加ROS积累[32]。脂质过氧化是铁死亡的关键因素,细胞内的GSH减少使其抗氧化能力减弱,导致胞内过氧化物积累发生脂质过氧化,引起细胞发生铁死亡[33]。GPX4利用其催化活性,削弱脂质过氧化物毒性,维持膜脂质双分子层稳态;抑制GPX4导致细胞内过氧化物的堆积,引发铁死亡[29]。作为GPX4催化过氧化物转化为醇的协同因子,GSH缺乏会引发半胱氨酸缺乏,将直接致GPX4失活,引发铁死亡[29]。Fer-1是铁死亡Xc-/GPX4通路抑制剂,通过抑制脂质过氧化发挥作用。研究表明,Fer-1通过提高GSH、GPX4水平抑制细胞的铁死亡[34]。本研究发现电针能够提高GSH和GPX4的表达,与抑制剂Fer-1的作用一致,说明电针能够通过抑制铁死亡通路促进脊髓损伤。在一项心肌损伤的研究中也发现电针能通过提高GSH、GPX4表达抑制铁死亡的发生[35]。

综上所述,夹脊电针可改善脊髓损伤大鼠神经功能及后肢运动功能,其修复作用可能通过调节铁死亡途径抑制神经元死亡。因SCI的病理机制十分复杂,需更加深入地探究夹脊电针对铁死亡通路的调控作用机制。