产朊假丝酵母发酵蛋白桑的培养基优化

侯俊豪，陈帅君，吴 疆，米琴娜，张熙凯，童应凯

天津农学院农学与资源环境学院生物技术系 天津 300384

0 引 言

蛋白质桑树又称饲料桑树，是我国的一种优质蛋白桑树品种。桑叶宽而丰满，具有极其丰富的营养物质，粗蛋白质含量20%～30%，桑树分支上的蛋白质有8%以上，碳水化合物含量0%～5%，还含有17 种氨基酸及钾、钙、铜、锌、锰、VC、VB和VA，尤其是脱氧核糖核酸。脱氧核糖核酸是一种很强的葡萄糖苷酶抑制剂，具有抑制糖转化、提高人体免疫力和抗病性等药理作用［1-2］。桑树叶含有丰富的蛋白质、脂肪酸、碳水化合物、纤维素及多种维生素［3］和矿物质。经过提取工艺优化，蛋白桑的蛋白质提取率可达40%以上，粗蛋白的含量与大多数豆科类牧草非常接近，但粗纤维含量更低，鉴于此，蛋白桑饲料［4-5］的研究和开发利用成为热点。将桑叶加入断奶仔猪的饲料中可提高仔猪的抗氧化能力和抗病能力［6］。李玉荣［7］的研究报道中提到，在保育猪的饲料中添加5%的新鲜桑叶后，猪群的腹泻率降低，血清中尿素氮含量提高，血糖和总胆固醇含量降低，能够提高猪的生长能力，并具有较强的抗痢性。王崇洲等［8］的研究结果表明，在肉兔饲料中加入15%的桑叶能显著提高肉兔的全净膛和半净膛率，以及肌肉中脂肪、蛋白质、风味氨基酸等的含量，肉色红度、亮度和肌肉pH显著升高。在日粮中添加桑叶粉后，泌乳水牛的生长激素、催乳素和甲状腺素等激素的分泌增加，日产奶量、乳汁中蛋白质和脂肪含量显著升高［9］。研究发现，在肉羊饲粮中添加桑叶能够降低羊肉膻味，提高熟肉率和嫩度，肉中蛋白质和脂肪等营养物质含量也有明显提升［10］。

在当前优质牧草资源严重短缺、饲料价格上涨的背景下，把桑叶作为新型的饲料资源，不仅能提高利用率，还能提升蚕桑体系的综合经济效益。但桑叶中存在单宁、植酸等抗营养因子，摄入过多会使牲畜的摄取能力受到限制，最终使其生长能力下降。发酵、蒸煮等能在一定程度上降低豆科作物中的单宁、植酸等抗营养因子含量，但如何降低或消除桑叶中的抗营养因子，且将桑叶更好地应用于动物饲料，需要进一步深入探究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

产朊假丝酵母，保藏于天津农学院生物技术系微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

加入主原料10 g（其中含8 g 蛋白桑及2 g 麸皮），以此为培养基底物，加入一定量的蒸馏水。

1.1.3 供试材料

蛋白桑粉：市场购蛋白桑，60 ℃烘干2 h后粉碎获得。

1.2 单因素试验

1.2.1 确定最佳KH2PO4用量

根据上文1.1.2 培养基的配方，在已有原料的基础上分别加入0.005、0.01、0.015、0.02、0.025 g KH2PO4。按照培养基制备方法进行试验。试验结束后，在40 倍光学显微镜下，用血球计数法测定产朊假丝酵母菌的菌数，以确定最佳的KH2PO4用量。重复试验3 次。

1.2.2 确定最佳（NH4）2SO4用量

根据上文1.1.2 培养基的配方，在已有原料的基础上分别加入0.05、0.1、0.15 g的（NH4）2SO4固体颗粒。按照培养基制备方法进行试验。试验结束后，在40 倍光学显微镜下，用血球计数法测定产朊假丝酵母菌的菌数，以确定最佳的（NH4）2SO4用量。重复试验3 次。

1.2.3 确定最佳MgSO4用量

根据上文1.1.2 培养基的配方，在已有原料的基础上分别加入0.5、1、1.5 g MgSO4。按照培养基制备方法进行试验。试验结束后，在40 倍光学显微镜下，用血球计数法测定产朊假丝酵母菌的菌数，以确定最佳的MgSO4用量［11］。重复试验3 次。

1.2.4 确定最佳葡萄糖用量

根据上文1.1.2 培养基的配方，在已有原料的基础上分别加入0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 g 的葡萄糖固体颗粒。按照培养基制备方法进行试验。试验结束后，在40 倍光学显微镜下，用血球计数法测定产朊假丝酵母菌的菌数，以确定最佳的葡萄糖用量。重复试验3 次。

1.2.5 确定最佳加水量

根据上文1.1.2 培养基的配方，在已有原料的基础上分别加入0.1 g（NH4）2SO4、0.01 g KH2PO4、0.6 g葡萄糖、0.001 g MgSO4，改变培养基中蒸馏水的添加量为10、12、14、16、18、20 mL。按照培养基制备方法进行试验。试验结束后，在40 倍光学显微镜下，用血球计数法测定产朊假丝酵母菌的菌数，以确定最佳加水量。重复试验3 次。

1.3 正交试验

1.3.1 对添加剂的正交试验

根据单因素试验结果，为探究产朊假丝酵母的最适宜生长条件、优化培养基配方，进行KH2PO4、蒸馏水、MgSO4、葡萄糖、（NH4）2SO4五因素四水平 L16（45）正交试验，正交因素水平设计见表1，正交处理表见表2。按照上文1.1.2 中的培养基制备方法进行发酵。发酵结束后，使用40 倍光学显微镜，用血球计数板进行计数，得到产朊假丝酵母菌菌数，最后筛选出最优组合。

表1 产朊假丝酵母菌发酵正交水平Tab.1 Orthogonal fermentation level of Candida utilis

表2 产朊假丝酵母菌发酵正交处理表Tab.2 Orthogonal fermentation treatment table of Candida utilis

1.3.2 正交试验准确性验证

在单因素试验的基础上，根据正交试验结果，得到产朊假丝酵母菌的培养基最佳配方。重复试验3 次，验证其准确性。

1.4 产朊假丝酵母菌菌数的测定方法

取一支50 mL的离心管,在离心管中加入1 g培养好的样品，加入蒸馏水至30 mL，旋涡振荡仪振荡3 min左右，振荡结束后用移液管吸取1 mL样品加入10 mL 刻度试管，加蒸馏水至10 mL，振荡混匀，用微量移液器吸取100 μL菌液在血球计数板上，用40 倍光学显微镜观察和计数。公式如下：

酵母细胞数值/1 g=（80 个小方格细胞总数/80×400×104×稀释倍数）/样品量

1.5 数据处理方法

利用显微镜和血球计数板测定产朊假丝酵母菌的菌数。利用Excel软件，算出平均值和极差，并绘制柱形图。利用SPSS数据处理软件，处理数据的计算标准差、相关性和显著性。

2 结果与分析

2.1 KH2PO4 对产朊假丝酵母菌发酵的影响

为了探究KH2PO4含量对产朊假丝酵母发酵的影响，设置了以下几组不同的KH2PO4含量试验，结果见图1。

图1 KH2PO4 对酵母菌发酵的影响Fig.1 Effect of KH2PO4 on yeast fermentation

在培养基中加入KH2PO4，磷和钾是微生物生长繁殖所必需的因素。KH2PO4整体呈现弱酸性，在培养基中具有缓冲液作用，能够维持酵母菌生长繁殖所需要的离子环境。当KH2PO4加入量过多时，培养基中pH波动幅度较大，导致酵母菌数量减少。

后续正交试验中的KH2PO4水平选取0.015 g及其左右的数值浓度（即0.01、0.015、0.02、0.025 g）进行。

2.2 (NH4)2SO4 对产朊假丝酵母菌发酵的影响

为了探究（NH4）2SO4含量对产朊假丝酵母发酵的影响，设置了以下几组不同的（NH4）2SO4含量试验，试验结果见图2。

图2 （NH4）2SO4 对酵母菌发酵的影响Fig.2 Effect of（NH4）2SO4 on yeast fermentation

在发酵过程中，产朊假丝酵母菌消耗碳源，产生酸性物质，导致培养基中的酸碱环境发生变化，影响产朊假丝酵母菌的生长繁殖。（NH4）2SO4是一种酸性盐，其中的铵离子是缓冲离子，在为培养基提供氮源的同时，也作为缓冲液调节培养基中的酸碱平衡。当（NH4）2SO4加入量过多时，产朊假丝酵母菌的生长繁殖速率下降，产朊假丝酵母菌数量也因此减少。

后续正交试验中的（NH4）2SO4水平选取0.1 g及其左右的数值浓度（即0、0.05、0.1、0.15 g）进行。

2.3 MgSO4 对产朊假丝酵母菌发酵的影响

为了探究MgSO4含量对产朊假丝酵母发酵的影响，设置了以下几组不同试验，结果见图3。

图3 MgSO4 对酵母菌发酵的影响Fig.3 Effect of MgSO4 on yeast fermentation

MgSO4中含有大量的镁离子，镁离子是一种活化剂，能够为产朊假丝酵母菌的生长繁殖提供无机营养元素。MgSO4可促进培养过程中各反应的进行，能够加快产朊假丝酵母菌的生长繁殖速度，使培养基上产朊假丝酵母菌的菌数增多。当MgSO4加入量过多时，培养基中盐含量较高，细胞的渗透压增大，导致酵母菌失水死亡，使产朊假丝酵母菌菌数减少。

后续正交试验中的MgSO4水平选取0.001 g及其左右的数值浓度（即0、0.000 5、0.001、0.001 5 g）进行。

2.4 葡萄糖对产朊假丝酵母菌发酵的影响

为了探究葡萄糖含量对产朊假丝酵母菌发酵的影响，设置了以下几组不同葡萄糖含量试验，试验结果见图4。

图4 葡萄糖对酵母菌发酵的影响Fig.4 Effect of glucose on yeast fermentation

葡萄糖在产朊假丝酵母的发酵培养基中有重要作用。发酵系统中，葡萄糖为主要供能物质。在培养基中，葡萄糖为碳源，能为产朊假丝酵母菌的生长繁殖提供所需要的营养物质。发酵过程中，将葡萄糖转化为其他物质，作为原料可以使反应继续顺利进行。葡萄糖浓度过高会抑制菌体的生长繁殖，导致产朊假丝酵母菌的菌数减少。

后续正交试验中的葡萄糖水平选取0.9 g及其左右的数值浓度（即0.6、0.9、1.2、1.5 g）进行。

2.5 加水量对产朊假丝酵母菌发酵的影响

为了探究水的含量对于产朊假丝酵母发酵的影响，设置了以下几组不同的加水量试验，试验结果见图5。

图5 加水量对酵母菌发酵的影响Fig.5 Effect of water addition on yeast fermentation

水是微生物生长所必需的物质。本次试验中，在培养基中加入一定量的蒸馏水，为产朊假丝酵母菌提供良好的生长繁殖环境，同时将其作为溶剂，溶解培养基中的蛋白桑、麸皮和无机盐。加入蒸馏水后，让培养基中各组分充分混合均匀。但若添加量过多会导致培养基中各物质的浓度降低，从而影响酵母菌的生长繁殖速率，使得产朊假丝酵母菌的菌数减少［12］。

后续正交试验中的水添加量水平选取16 mL及其左右的数值（即12、14、16、18 mL）进行。

2.6 正交试验结果分析

根据单因素试验结果，对5 个单因素进行正交试验，测定产朊假丝酵母菌数量，最终数据见表3、4。

表3 正交试验结果及标准差Tab.3 Orthogonal experimental results and standard deviation

葡萄糖在发酵过程中能提供碳源，是影响酵母菌发酵最主要的因素［13］，可在产朊假丝酵母菌发酵的培养基中（NH4）2SO4作为氮源存在，在整个发酵过程中具有重要作用。KH2PO4呈弱酸性，在培养基中可作为缓冲液，能够维持酵母菌生长繁殖所需要的离子环境，也会在一定程度上对产朊假丝酵母菌的生长繁殖产生影响［14］。MgSO4作为活化剂，促进发酵过程中各种反应的进行。由表3 可知，葡萄糖、水和（NH4）2SO4的含量呈正相关，而MgSO4和KH2PO4的含量与测试结果呈负相关。由表4 可知，5 个因素对产朊假丝酵母菌数量的影响都极显著（P＜0.01）。

表4 5 个因素对产朊假丝酵母菌菌数影响的方差分析Tab.4 Variance analysis of influence of five factors on number of Candida utilis

由表3 中K值分析可知，产朊假丝酵母菌最佳培养基配方为1.2 g葡萄糖、0.025 g KH2PO4、0.05 g（NH4）2SO4、0.001 g MgSO4、16 mL蒸馏水，经3 次重复得到的菌数平均值为10.05 亿/g。

3 结 语

本试验主要是对桑叶进行研究，以产朊假丝酵母粉为发酵菌种，发酵培养基中的底物为8 g蛋白桑和2 g麸皮，对KH2PO4、蒸馏水、MgSO4、葡萄糖、（NH4）2SO45 种单因素进行正交试验，根据结果，得到发酵产朊假丝酵母的最佳培养基中各种微量元素的含量为1.2 g葡萄糖、0.025 g KH2PO4、0.05 g（NH4）2SO4、0.001 g MgSO4、16 mL蒸馏水。在120 ℃下灭菌25 min，冷却至室温，加入0.1 g的产朊假丝酵母粉，置于电热恒温培养箱中28 ℃培养48 h，此时得到的产朊假丝酵母菌数量最多、产朊假丝酵母能在最佳条件下生长繁殖，菌数能够达到10.05 亿/g酵母菌。■