新版人畜共患传染病名录病种检测技术浅析

吕伟军,沈红霞,池丽娟,杨 磊,孙思琪,周 炜

(1.浙江省动物疫病预防控制中心,浙江 杭州 311119;2.中国动物疫病预防控制中心)

习近平总书记在中共中央政治局第三十三次集体学习时强调“要实行积极防御、主动治理,坚持人病兽防、关口前移,从源头前端阻断人兽共患病的传播路径”。目前,有记载的人兽共患病有200余种,有些病种尚无有效检测标准,有些病种检测方法林林总总,有些病种已有检测用试剂盒但尚未标准化或尚未在较大范围内试用、验证。如何切实有效开展针对性防控、严守生物安全底线,是每一个畜牧兽医工作者需要面对的问题。

2023年6月,农业农村部针对全国现在主要人畜共患病流行情况,发布了新修订的人畜共患传染病名录,共收录24种人畜共患传染病,包括4种病毒病、8种细菌病、8种寄生虫病和4种其他疫病(朊病毒、立克次氏体、螺旋体和衣原体),为开展针对性的防控指明了方向。因而,对于这些病种的检测所采用的权威检测标准、确诊方法以及检测过程中需要处于何种生物安全级别成为疫病检测实验室的重中之重。本文旨在梳理新版人畜共患传染病名录中24个病种的现行有效的检测标准(国际标准、国家标准和行业标准)和开展相应实验室检测活动所需生物安全级别,以期为相应检测的开展提供更为明析的参考。以下各病种情况具体见表1。

表1 相关疾病实验室检测规范

1 病毒病

1.1高致病性禽流感 高致病性禽流感的病原为禽流感病毒,按照中华人民共和国农业部令 第53号《动物病原微生物分类名录》和《农业部关于进一步规范高致病性动物病原微生物实验活动审批工作的通知》(农医发[2008]27号)的规定(后续病种同此依据),属第一类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验需在生物安全第三级实验室(以下简称三级实验室,其他级别同)条件下开展;未经培养的感染性材料实验(感染性材料处理需在Ⅱ级生物安全柜中进行)、灭活材料实验需在二级实验室条件下开展。按照世界动物卫生组织(WOAH;原为OIE)《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,禽流感为A类疾病。

我国主要现行检测标准见表1,《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法,指定的替代诊断方法为琼脂凝胶免疫扩散试验和血凝试验。

现在《GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术》所涉及的试剂均有商品化试剂盒,所需鸡红细胞也相对易于获取与制备,因而该标准使用较为广泛。除该标准所述方法以外,还有乳胶凝集试验、琼脂凝胶扩散试验、神经氨酸酶抑制试验、ELISA、H5亚型AIV胶体金诊断试验、免疫荧光技术、PCR-ELISA技术、核酸依赖的扩增技术和基因芯片技术等方法。

1.2狂犬病 狂犬病的病原为狂犬病病毒,属第二类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验和未经培养的感染性材料实验需在三级实验室条件下开展,灭活材料实验需在二级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,狂犬病为B类多种动物共患病。

我国主要现行检测标准见表1,《国际动物卫生法典》尚未指定其替代诊断方法,指定的诊断方法为病毒中和试验。

除表内列入方法外,还有关于竞争ELISA、双抗夹心ELISA、间接免疫荧光、快速荧光灶抑制试验和胶体金免疫层析技术等抗体检测技术,乳胶凝集试验、荧光抗体试验、原位杂交、基因芯片和核酸环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification, LAMP)等抗原检测技术。目前,已有狂犬病抗体ELISA检测的商品化试剂盒,适用于可疑病犬的初步诊断或狂犬病疫苗免疫合格率的监测,该方法更简便易行。

1.3日本脑炎(流行性乙型脑炎) 日本脑炎的病原为日本脑炎病毒,属第三类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验需在二级实验室条件下开展,灭活材料实验则仅需在一级实验室条件下开展。与我国将其归类为猪病病原微生物不同,《OIE 陆生动物卫生法典》将日本脑炎归为B类马病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和替代诊断方法。

除表内列入方法外,还有免疫荧光试验、乳胶凝集试验、SPA协同凝集试验、HRP-SPA ELISA、Dot-ELISA、胶体金、免疫层析试纸法和斑点金免疫渗透法等血清学方法,RT-PCR、套式RT-PCR、LAMP技术、TaqMan荧光探针、SYBR荧光染料法和基因芯片技术等分子生物学方法。

1.4尼帕病毒性脑炎 尼帕病毒性脑炎的病原为尼帕病毒,该病为外来病种,《动物病原微生物分类名录》尚未收录,《OIE 陆生动物卫生法典》中将其归为生物安全第四级病原体,属B类国际贸易中的其他重要疾病(尼帕病毒)。

我国主要现行检测标准见表1《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和指定替代诊断方法。

目前,我国对尼帕病毒的研究报道相对较少。樊欢等基于多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色技术,建立了一种包括尼帕病毒在内的5种脑炎脑膜炎病毒检测技术。

2 细菌病

2.1炭疽 炭疽的病原为炭疽芽孢杆菌,属第二类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验和未经培养的感染性材料实验需在三级实验室条件下开展,灭活材料实验需在二级实验室条件下开展。炭疽未收录进《OIE 陆生动物卫生法典》。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和替代诊断方法。

除表内列入方法外,更高层次的方法还有基于芽孢、细菌繁殖体、基因、毒素蛋白的检测方法。王素华等基于炭疽杆菌2个不同位点的基因片段建立了双重荧光PCR检测技术,以提高其分子生物学检测的敏感性和准确度。目前,已有炭疽病菌核酸检测的商品化试剂盒,适用范围包括可疑病料及可疑病畜接触过环境的初步判定检测。

2.2布鲁氏菌病 布鲁氏菌病的病原为布氏杆菌,属第二类动物病原微生物,病原分离培养和动物感染实验需在三级实验室条件下开展,未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验需在二级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,布鲁氏菌病为B类牛病、绵羊和山羊病、猪病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》中指定牛布病的诊断方法为缓冲布氏杆菌抗原试验(BBAT)、补体结合试验(CF)和ELISA,替代诊断方法为荧光偏振试验(FPA);山羊和绵羊布病的诊断方法为BBAT和CF,替代诊断方法为布鲁氏菌素试验;猪布病的诊断方法为ELISA,替代诊断方法为BBAT和FPA。

近年来,胶体金快速检测技术也得到了快速发展与应用,部分产品的灵敏度与ELISA方法相当、准确性略优于ELISA方法,但多数品牌的产品同样不适用于粗糙型布鲁氏菌的检测。此外,由中国兽医学会颁布的团体标准《T/CVMA 20动物布鲁氏菌实时荧光PCR检测方法》中规定了适用于动物脾脏、肝脏、淋巴结、血液、奶样、精液、阴道分泌物、流产胎儿内容物和被布鲁氏菌污染的环境样品中布鲁氏菌实时荧光PCR检测方法,为环境样品的布病检测提供了新的解决方案。

2.3沙门氏菌病 沙门氏菌病的病原为沙门氏菌,属第三类动物病原微生物,病原分离培养和动物感染实验需在二级实验室条件下开展,未经培养的感染性材料和灭活材料实验则仅需在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,沙门氏菌病为B类国际贸易中的其他重要疾病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法,指定替代诊断方法为病原鉴定。

目前,除表内列入方法外,关于ELISA(双抗体夹心、直接、间接)、免疫磁珠分离、免疫荧光检测等免疫分析检测技术,RT-PCR、LAMP、基因芯片等分子生物学检测方法,生物传感器检测技术、纳米技术等新型检测技术被运用于沙门氏菌病检测。

2.4牛结核病 牛结核病的病原为结核分枝杆菌(以牛分枝杆菌为主),属第三类动物病原微生物,病原分离培养和动物感染实验需在三级实验室条件下开展,未经培养的感染性材料需在二级实验室条件下开展(感染性材料处理需在Ⅱ级生物安全柜中进行),灭活材料实验仅需在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,牛结核病为B类牛病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其替代诊断方法,指定诊断方法为结核菌素试验。

除表内列入的方法外,针对牛结核病的实验室检测还有ELISA、免疫斑点测定法、荧光偏振检测法、斑点金免疫渗滤试验、免疫印迹法、固相抗体竞争试验、固相抗体竞争夹心酶联法、胶体金等血清学检测方法,DNA探针、指纹、图谱技术等分子生物学方法。

2.5猪链球菌Ⅱ型感染 猪链球菌Ⅱ型感染的病原为猪链球菌Ⅱ型,致病性链球菌属第三类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验需在二级实验室条件下开展,灭活材料实验则仅需在一级实验室条件下开展。猪链球菌Ⅱ型感染未收录进《OIE 陆生动物卫生法典》。

我国主要现行检测标准见表1。猪链球菌Ⅱ型感染未收录进《国际动物卫生法典》。

目前,关于猪链球菌的检测技术研究包括病原学、分子生物学、分子分型和免疫学方法。病原学集中在优化细菌的选择性分离培养方向,分子生物学检测方法主要有PCR、多重PCR、荧光定量PCR、LAMP和基因芯片技术,分子分型已有多位点序列分型、随机扩增多态性DNA、核糖体分型、脉冲场凝胶电泳等方法的研究报道,免疫学方法则有ELISA法、胶体金法和电化学免疫传感器技术等。

2.6马鼻疽 马鼻疽的病原为鼻疽伯克霍尔德氏菌(原名为鼻疽假单胞菌),属第三类动物病原微生物,马鼻疽在我国为已消灭病种。病原分离培养、动物感染实验和未经培养的感染性材料实验需在二级实验室条件下开展,灭活材料实验可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,马鼻疽为B类马病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其替代诊断方法,其指定诊断方法为马来因试验(即鼻疽菌素点眼试验)。

2.7李氏杆菌病 李氏杆菌病的病原为李氏杆菌(现行标准中用名还涉及:李斯特菌、李斯特氏菌、单核细胞增多性李斯特杆菌),属第三类动物病原微生物,病原分离培养和动物感染实验需在二级实验室条件下开展,未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,李氏杆菌病为B类国际贸易中的其他重要疾病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和替代诊断方法。

2.8类鼻疽 类鼻疽的病原为类鼻疽伯克霍尔德菌,属第三类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验和未经培养的感染性材料实验需在二级实验室条件下开展,灭活材料实验可在一级实验室条件下开展。类鼻疽未收录进《OIE 陆生动物卫生法典》。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和替代诊断方法。

此外,类鼻疽病原的检测方法还包括LF-RPA法、LAMP-纳米生物传感器快速检测法。

3 寄生虫病

3.1弓形虫病 弓形虫病的病原为龚地弓形体,属第四类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验均可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,弓形虫病为B类国际贸易中的其他重要疾病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和替代诊断方法。

3.2棘球蚴病 棘球蚴病又称包虫病,病原为棘球绦虫(棘球绦虫的幼虫称棘球蚴),属第四类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验均可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,棘球蚴病为B类多种动物共患病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和替代诊断方法。

3.3日本血吸虫病 日本血吸虫病的病原为日本血吸虫病,属第三类动物病原微生物,病原分离培养和动物感染实验需在二级实验室条件下开展,未经培养的感染性材料和灭活材料实验仅需在一级实验室条件下开展。日本血吸虫病未收录进《OIE 陆生动物卫生法典》。

我国主要现行检测标准见表1。日本血吸虫病未收录进《国际动物卫生法典》。

3.4旋毛虫病 旋毛虫病的病原为旋毛虫,属第四类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验均可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,旋毛虫病为B类多种动物共患病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》指定其诊断方法为病原鉴定,指定替代诊断方法为ELISA法。

3.5囊尾蚴病 囊尾蚴病的病原为猪带绦虫的幼虫,属第四类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验均可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,囊尾蚴病为B类牛病、猪病和国际贸易中的其他重要疾病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其替代诊断方法,其指定诊断方法为病原鉴定法。

3.6片形吸虫病 片形吸虫病的病原为片形吸虫(复殖目片形科片形属,主要为:肝片吸虫和大片形吸虫),属第四类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验均可在一级实验室条件下开展。片形吸虫病未收录进《OIE 陆生动物卫生法典》。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和替代诊断方法。

3.7利什曼原虫病 利什曼原虫病的病原为利什曼原虫属原虫,属第四类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验均可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,利什曼原虫病为B类多种动物共患病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法,指定替代诊断方法为病原鉴定。

3.8华支睾吸虫病 华支睾吸虫病的病原为华支睾吸虫(复殖目后睾科支睾属),属第四类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验均可在一级实验室条件下开展。华支睾吸虫病未收录进《OIE 陆生动物卫生法典》。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和指定替代诊断方法。

除表内经典的病原学诊断外,主要还有分子生物学诊断方法(包括:PCR法、LAMP、荧光PCR法和数字PCR法等)、免疫学诊断(包括:染色试验、间接血凝试验、凝集试验、间接荧光抗体试验、ELISA法、胶体金法等)。由于这些方法原理基本相同,特定基因、蛋白的改变,且很多尚未标准化、商品化,本文不作一一赘叙。

4 其他疫病

4.1牛海绵状脑病 牛海绵状脑病的病原为朊病毒,属第一类动物病原微生物,其相关实验活动(病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验)均需在三级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,牛海绵状脑病为B类牛病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和替代诊断方法。

牛海绵状脑病为外来疫病,其检测主要集中于出入境检疫环节。何俭和彭钰欣等的论文显示,除表内方法外,还有小鼠接种试验、电镜检查和ELISA等方法。两研究均认为因存在300 d的潜伏期,小鼠试验实用性差;脑切片HE染色镜检法对检验人员经验要求较高;电镜法仅适用于新鲜或仅经冷冻处理过的脑组织样本;而免疫组化法和免疫转印法有相对较高的准确性。

4.2Q热 Q热的病原为伯纳特柯克斯体(一种专性细胞内寄生菌),属第四类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验、未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验均可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,Q热为B类多种动物共患病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法,指定替代诊断方法为补体结合试验。

目前,鲜有Q热病的新的血清学检测技术研究报道,基于分子生物学的病原学检测中PCR、LAMP、重组酶聚合酶扩增、基因芯片等检测技术则不断被引入。

4.3钩端螺旋体病 钩端螺旋体病的病原为致病性钩端螺旋体,属第三类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验需在二级实验室条件下开展,未经培养的感染性材料实验和灭活材料实验则可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,钩端螺旋体病为B类多种动物共患病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法,指定替代诊断方法为显微凝集试验。

现有文献显示,除病原学和血清学诊断方法外,PCR、荧光PCR、基因芯片等分子生物学技术也被应用于钩端螺旋体的诊断和分型。

4.4鹦鹉热 鹦鹉热(现行标准用名还涉及:禽衣原体病)的病原为鹦鹉热衣原体,属第三类动物病原微生物,病原分离培养、动物感染实验和未经培养的感染性材料实验需在二级实验室条件下开展,灭活材料实验可在一级实验室条件下开展。按照《OIE 陆生动物卫生法典》的分类,鹦鹉热(禽衣原体病)为B类禽病。

我国主要现行检测标准见表1。《国际动物卫生法典》尚未指定其诊断方法和替代诊断方法。

根据韩娥等的综述,鹦鹉热基因检测方法中新出现了DNA微阵列技术,乳胶凝集、原生小体凝集、间接血凝、胶体金等血清学检测方法也先后被引入,且胶体金技术已获新兽药证书。

5 展望

随着全球人流和物流不断加深,加之动物的跨地域迁徙、病毒的不断变异,人畜共患传染病的防控压力也不断加大。在新形势下,防疫基层一线、养殖主体合理科学地根据实际情况选择相应的检测技术势在必行,复核确诊单位则需选择相对权威的符合生物安全防控要求的检测方法和确诊标准,使更大范围内对疫情的处置措施更加科学、合理和严谨。在新的检测技术研究、检测标准制订、试剂盒研发工作者的共同努力和不懈奋斗下,我国人畜共患传染病的防控工作必将走上更高的台阶。