糖萼组分在不同类型抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎中的变化及其与疾病活动度的关系

孙若兰 陈怿鹏 高鹏丽 邢广群

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)是一组累及多系统的自身免疫性疾病,以全身小血管坏死性炎症为特征。AAV可导致多个器官组织损伤及功能障碍,严重影响患者预后[1-2]。目前研究结果发现,糖萼(GCX)与AAV的发生及发展有着密切联系[3]。GCX是覆盖在血管内皮表面的一层多糖-蛋白质复合物,在维持血管通透性、参与凝血和血栓形成、调节内皮和循环血细胞之间的相互作用等方面具有重要作用。生理状态下GCX是动态变化的,其合成与降解维持相对稳态,在受到炎症、氧化应激、高血压等病理刺激下会大量降解脱落[4],失去对内皮的保护作用。AAV以血管受累为特征,GCX的破坏反映血管内皮损伤程度,其片段脱离血管内皮入血,动态影响循环中糖链含量。但由于糖链结构复杂多变、种类繁多,检测技术受限,临床应用困难,且用某一种或几种多糖代表GCX的损伤程度是不全面的。故本研究采用一种新型PCR酸降解衍生法处理糖链,形成的降解单糖通过高效液相色谱法(HPLC)进行定量检测,通过分析单糖组分,间接反映血清中糖链组成的变化,这一技术称为“糖指纹”[5]。“糖指纹技术”是青岛大学附属医院系统生物学实验室申请的一种检测血液中单糖组分的专利技术(CN20140211976.3、CN201710394424.4、CN201810298226),可简单快捷地进行血清单糖的定性和定量分析。本研究通过检测AAV患者血清降解单糖组分的变化,反映血管内皮的损伤程度,从GCX损伤的角度探寻AAV的发病机制及病情变化。

对象与方法

1.对象:2020年6月16日～2021年3月12日于我院就诊的AAV患者49例作为AAV组。纳入标准:(1)符合Chapel Hill共识会议的AAV诊断标准[6];(2)年龄≥18岁。排除标准:合并乙型肝炎、结核、恶性肿瘤、系统性红斑狼疮。纳入同期于我院体检中心进行健康体检、与AAV组患者性别及年龄完全匹配的健康者53例作为对照组。根据AAV活动度将AAV患者分为非活动组(BVAS=0分)5例、活动组(1分≤BVAS≤15分)33例及高度活动组(BVAS≥16分)11例。本研究经我院医学伦理委员会审核批准(QYFY WZLL 27037),所有受试者均签署知情同意书。

2.方法

(1)资料收集:两组受试者的一般临床资料(包括性别、年龄、BMI、吸烟史、血压)和实验室检查指标[包括两组受试者的血中性粒细胞计数、血RBC计数、白蛋白(Alb)、血肌酐(SCr)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)、血尿酸(SUA)及AAV组患者24 h尿蛋白定量、Hb、尿RBC计数、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、D-二聚体],采用Cockcroft-Gault公式计算AAV患者估算的肾小球滤过率(eGFR)。采用伯明翰血管炎活动评分(BVAS)2003[7]评估AAV活动度;采用血管炎损伤指数(VDI)评分评估AAV患者不可逆的慢性损伤。

(2)单糖测定:实验步骤及方法参照Zhang等[8]的方法进行。首先制备不同浓度的单糖标准品并采用PCR仪辅助酸降解法进行血清的酸降解。将标准品及降解后的每个血清样品经过单糖衍生程序、萃取、离心等,最终取50 μl上清液于棕色上样瓶内保存。随后用HPLC分析出每种单糖标准品的峰面积并绘制峰面积-浓度标准曲线,将每种单糖各自的峰面积带入标准曲线后即可得到血清样品中降解单糖水平。

结 果

1.AAV组和对照组受试者一般临床资料及实验室检查指标比较:AAV组有吸烟史受试者比例、收缩压、舒张压、血中性粒细胞计数、SCr及SUA水平均高于对照组,血RBC计数和Alb均低于对照组(P<0.05),而两组受试者性别、年龄、BMI、LDL-C、TG及FPG水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 AAV组和对照组受试者一般临床资料及实验室检查指标比较[M(P25,P75)]

2.AAV患者的临床特征:40例(81.6%)患者检测到MPO-ANCA(MPO-ANCA组),8例(16.3%)患者检测到蛋白酶3(PR3)-ANCA(PR3-ANCA组),MPO-ANCA组和PR3-ANCA组BVAS比较差异无统计学意义[6.0(2.3,13.8)分比16.5(3.5,20.0)分,Z=-1.400,P=0.161]。1例(2.0%)患者同时检测到MPO-ANCA和PR3-ANCA,其BVAS为24.0分。39例(79.6%)患者诊断为显微镜下多血管炎(MPA,MPA组),9例(18.4%)患者诊断为肉芽肿性多血管炎(GPA,GPA组),MPA组和GPA组BVAS比较差异无统计学意义[6.0(2.0,14.0)分比19.0(4.0,22.0)分,Z=-1.800,P=0.072]。1例(2%)患者诊断为嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA),其BVAS为6.0分。49例AAV患者的BVAS为6.0(3.0,15.0)分,VDI评分为(4.38±2.17)分。

3.AAV组和对照组受试者血清降解单糖水平比较:AAV组受试者血清降解岩藻糖(Fuc_de)、降解半乳糖胺(GalN_de)、降解葡萄糖(Glc_de)、降解甘露糖(Man_de)及总血清降解单糖水平均高于对照组(P<0.05),而两组受试者降解半乳糖(Gal_de)及降解葡萄糖胺(GlcN_de)水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 AAV组和对照组受试者血清降解单糖水平比较[mmol/L,M(P25,P75)]

4.AAV患者血清降解单糖水平与各临床指标的相关性:Spearman相关分析结果显示,AAV患者血清Fuc_de与血中性粒细胞计数及ESR均呈负相关,Glc_de、Man_de及总血清降解单糖水平与ESR及CRP均呈正相关(P<0.05),而其他血清降解单糖水平与其他临床指标均无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 AAV患者血清降解单糖水平与各临床指标的Spearman相关分析结果

5.MPA组和GPA组患者血清降解单糖水平比较:由于EGPA患者仅1例,因此只比较MPA组和GPA组患者血清降解单糖水平。MPA组患者总血清降解单糖水平高于GPA组(P<0.05),而两组患者其他血清降解单糖水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 MPA组和GPA组患者血清降解单糖水平比较[mmol/L,M(P25,P75)]

6.MPO-ANCA组和PR3-ANCA组患者血清降解单糖水平比较:MPO-ANCA组患者总血清降解单糖水平高于PR3-ANCA组(P<0.05),而两组患者其他血清降解单糖水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 MPO-ANCA组和PR3-ANCA组患者血清降解单糖水平比较[mmol/L,M(P25,P75)]

7.不同疾病活动度AAV患者血清降解单糖水平比较:非活动组、活动组及高度活动组AAV患者血清GalN_de水平比较差异有统计学意义,其中高度活动组高于非活动组(P<0.05);而3组AAV患者其他血清降解单糖水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 不同疾病活动度AAV患者血清降解单糖水平比较[mmol/L,M(P25,P75)]

8.不同疾病活动度的MPO-ANCA阳性AAV患者血清降解单糖水平比较:40例MPO-ANCA阳性AAV患者中,非AAV活动患者4例(非活动组),AAV活动患者30例(活动组),AAV高度活动患者6例(高度活动组),3组血清GalN_de水平比较差异有统计学意义,其中高度活动组高于非活动组(P<0.05);而3组其他血清降解单糖水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 不同疾病活动度的MPO-ANCA阳性AAV患者血清降解单糖水平比较[mmol/L,M(P25,P75)]

9.血清GalN_de水平对MPO-ANCA阳性AAV患者疾病高度活动的预测价值:ROC曲线分析结果显示,血清GalN_de水平预测MPO-ANCA阳性AAV疾病高度活动的ROC曲线下面积(AUC)为0.838(95%CI0.695～0.982,P=0.009),当血清GalN_de水平取最佳截断值0.204 mmol/L时,对应的敏感度为83.3%,特异度为79.4%,具有良好的预测价值。

讨 论

本研究结果显示,AAV组受试者Fuc_de、GalN_de、Glc_de、Man_de及总血清降解单糖水平均高于对照组,提示AAV患者体内存在明显的GCX破坏与脱落。血管损伤后不仅存在GCX的脱落,也伴随着GCX的合成,但当损伤严重时,其脱落损伤的速率会远远大于合成修复的速度,这与AAV的发病机制有关。既往研究发现,内皮细胞可不断感知细胞外环境并进行自我调节,但强炎症刺激下内皮细胞会出现活化、调节失衡和内皮屏障功能丧失,这是全身炎症期间免疫反应过度的特征标志[9]。活化的内皮特异性岩藻糖基化的表达可促进白细胞与L-选择素的相互作用进而促进炎症反应。本研究结果显示,AAV患者血清Glc_de、Man_de及总血清降解单糖水平与ESR及CRP均呈正相关,Fuc_de也与ESR存在相关性。上述研究结果支持了血管GCX的破坏与机体炎症状态存在密切关系。

本研究结果显示,MPA组患者总血清降解单糖水平高于GPA组,这与两种疾病类型的发病机制有关。虽然GPA和MPA均可发生全身小血管的免疫性坏死性血管炎,但GPA常出现坏死性肉芽肿性炎症,通常累及上呼吸道[10]。MPA最常表现为坏死性血管炎,无肉芽肿形成,血管内皮损伤相对严重[11]。表明两种疾病中血管内皮GCX的损伤程度不同,再次从血管损伤的角度揭示了二者发病机制上的差异。

GalN_de是由血清中N-乙酰氨基半乳糖胺水解、乙酰氨基脱落而形成,后者则是构成糖胺聚糖中硫酸软骨素的重复二糖单元之一[12]。本研究结果显示,高度活动组AAV患者血清GalN_de水平高于非活动组,提示血清GalN_de水平与AAV疾病活动度相关,AAV疾病高度活动状态下,GCX大量脱落和降解,血管内皮遭到严重破坏。同时,高度活动组MPO-ANCA阳性AAV患者血清GalN_de水平高于非活动组,ROC曲线分析进一步发现血清GalN_de水平对MPO-ANCA阳性AAV患者疾病高度活动有较好的预测价值。因此,GalN_de有望成为评估AAV疾病活动的潜在生物标志物[13]。

GCX的破坏是AAV患者血管损伤及功能障碍的重要过程,本研究通过对血清糖链的单糖组分进行定量分析来反映GCX的改变,对揭示疾病的损伤机制及评估病情具有重要意义。但本研究仍存在不足之处,首先,本研究样本量少且为单中心研究;其次,本研究局限于横断面研究,未进行纵向动态观察血清单糖组分与AAV病情发生发展的关系,后期将会继续扩大样本量并进行前瞻性研究。

综上,AAV患者血管内皮受损和GCX脱落后,血清单糖组分与患者的疾病状态密切相关,在揭示AAV发病机制和评估AAV病情严重程度中具有一定作用。