PIWI蛋白相互作用RNA-47851在胃腺癌中的表达及其对增殖的影响

朱锦丽, 乔欣悦, 严雪冰, 王成海

(1. 扬州大学附属医院 病案统计科, 江苏 扬州, 225009; 2. 扬州大学医学院 病理教研室, 江苏 扬州, 225009;3. 扬州大学附属医院 肿瘤科, 江苏 扬州, 225009)

胃癌(GC)是消化系统常见癌症类型,是来源于胃黏膜细胞和腺上皮的恶性肿瘤,病理组织学主要类型为胃腺癌。胃癌的发病率位于全部癌症的第4位,而病死率却位居第2位[1]。随着医学的不断进步,胃癌的诊治效果明显提升,但胃癌患者的5年存活率仍低于20%[2-3]。目前还未发现胃癌早期特异性和敏感性诊断指标。PIWI蛋白相互作用RNA(piRNA)是一种包含20～30个核苷酸的非编码RNA, 与PIWI蛋白结合发挥相应的生物学功能[4-5]。LIN X D等[6]在胃癌组织和邻近正常胃黏膜组织中检查了piRNA表达谱异常情况,结果发现piR-47851表达水平升高。本研究探讨piR-47851在大样本胃腺癌中的表达情况以及其生物学功能,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

选取2020年1月—2022年12月在扬州大学附属医院接受胃癌根治术并经病理检查确诊为胃腺癌的79例患者作为研究对象,其中男56例,女23例,年龄39～70岁,中位年龄55岁。纳入标准: ① 胃癌诊断符合《中华医学会胃癌临床诊疗指南(2021版)》[7], 均经术后病理诊断确诊者; ② 临床病理资料完整者; ③ 认知功能正常者,沟通无障碍,可进行术后随访; ④ 入组前未接受免疫治疗、放化疗等相关治疗者。排除标准: ① 合并有心脑血管疾病、传染性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病者; ② 妊娠期或哺乳期女性患者; ③ 有其他类型恶性肿瘤者。本研究经扬州大学附属医院伦理委员会审核备案(批准号: 2023-YKL11-006)。

1.2 细胞和质粒

人胃腺癌细胞SGC7901、AGS购自中科院上海细胞生物库,培养基分别为RPMI-1640和H-DMEM; GES-1细胞(人胃黏膜上皮细胞系)购自上海宾穗生物科技有限公司,培养基为RPMI-1640。所有细胞培养基中添加1%的青霉素/链霉素(Invitrogen公司)。细胞在37 ℃、5% CO2的潮湿培养箱中培养[8]。piR-47851模拟物/抑制剂的相关质粒和对照组均购自汉恒生物科技(上海)有限公司。使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)将相关质粒转染到胃腺癌细胞株中。主要基因的引物和序列见表1。

表1 主要基因的引物序列

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

使用TRIzol试剂(Invitrogen公司)分离胃癌组织总RNA。RNA的光密度(OD)A260/230比值>1.8。使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒(Takara), 并根据试剂盒说明书将RNA反向转录成cDNA。在Applied Biosystems 7500 PCR仪器上按照实时荧光定量试剂盒(Takara)的步骤进行qRT-PCR实验,步骤包括预变性(95 ℃ 30 s)、PCR反应(重复40个循环, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30～60 s)。

1.4 原位杂交实验

79例新鲜标本进行组织切片。在室温下,过氧化氢处理可消除内源性过氧化物酶; 使用胃蛋白酶消化组织切片; 采用预杂交液在培养箱中孵育组织切片,然后加入杂交液孵育12 h; 清洗后加入密封液; 加入生物素化地高辛; 组织中加入SABC; 加入生物素化过氧化物酶; 组织进行DAB染色、苏木精复染、洗涤、脱水、透明、封闭; 采用预杂交液代替含有探针的杂交液作为空白对照,piR-47851寡核苷酸探针序列为2条,第1条AUGCAGGCUCACUGCAACUUCCGCCU, 第2条AGAUGCACUUCCGCCUCCTGGGGUCA。

1.5 CCK-8实验

将胃癌细胞悬浮在96孔板的孔洞里,每个孔洞里加入100 μL[(4～5)×103个细胞],设置3个复孔; 置入5% CO2、37 ℃培养箱里中培养,直到铺满整个孔底; 每个孔中加入10 μL CCK-8溶液,轻轻击打培养板使细胞与溶液混匀,细胞培养箱中孵育4 h。使用酶标仪在450 nm可见光上计算吸收值(注意在结果中需要减去具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光值),计算出降低表达/过表达piR-47851对细胞的增殖活性影响。

1.6 双荧光素酶报告基因实验

PCR扩增包含piR-47851结合位点的MAPK1 3′UTR区域500个碱基,插入在荧光素酶表达载体pGL4.20载体质粒中,构建目的序列的重组载体,使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)根据产品说明书将相关pGL4.20质粒转染进胃癌细胞株中。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒,观察荧光素酶的发光情况,检测piR-47851对MAPK1 3′UTR的调控。实验分组分为MAPK1-WT(野生型)组和MAPK1-Mut(突变型)组。首先将样本和双荧光素酶报告试剂盒置于室温中,然后每孔加入100 μL萤火虫荧光素酶检测试剂,迅速加入20 μL样本,混匀后酶标仪读数,空白对照组为细胞裂解液组; 然后每孔中再加入100 μL海肾荧光素酶试剂,混匀后读数。比值计算: 海肾荧光素酶测定值/萤火虫荧光素酶测定值。

1.7 免疫组化实验

切片厚度4 μm, 烤片后二甲苯脱蜡,经无水酒精及梯度酒精直至水洗。采用H2O2孵育切片10 min, 灭活组织切片内源性的过氧化物酶,采用磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液洗净。将切片置于抗原修复液中修复抗原, PBS缓冲液冲洗。在正常羊血清封闭液中封闭。把封闭液去除后,滴加即用型一抗,放入4 ℃冰箱过夜; 滴加二抗(生物素标记), 37 ℃培养箱中孵育0.5 h, PBS缓冲液洗涤; 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液, 37 ℃孵育20 min, PBS缓冲液洗涤; DAB染色液显色,苏木素蓝色复染胞核,脱水,透明,封片,光镜下观察。阳性染色为棕黄色颗粒。采用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.8 裸鼠皮下移植瘤模型

BALB/C-nu/nu裸鼠来源于扬州大学动物实验中心,裸鼠质量25～28 g, 5～7周龄,分为实验组20只和对照组20只,饲养在SPF级动物培养箱里。在第4天于裸鼠右侧腋腹壁的皮下接种胃癌细胞100 μL, 约5×106个细胞。接种后每天监测裸鼠生活情况及皮下瘤组织生长情况。50 d后拉颈迅速处死裸鼠,完整剥离瘤体,对肿瘤体积大小和重量进行测量,并给予拍照。裸鼠研究获得扬州大学动物实验伦理委员会批准。

1.9 统计学分析

采用SPSS 16.0和Graph Pad 5.0软件分析数据和编辑图片。计数资料组间比较采用χ2检验,计量资料采用均数±标准差表示,均符合正态分布,组间比较采用t检验,多组间比较采用ANOVA检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 piR-47851在胃腺癌组织中的表达

qRT-PCR实验检测了79对胃腺癌肿瘤标本和邻近正常组织。在胃腺癌标本中, piR-47851表达水平为(3.120±1.564), 高于癌旁正常组织标本的(1.466±0.554), 差异有统计学意义(t=9.071,P<0.05); 在胃腺癌细胞SGC7901和AGS中, piR-47851表达水平均高于正常胃黏膜上皮GES-1细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。该结果提示piR-47851在胃腺癌中发挥促癌基因的作用。见图1。

2.2 原位杂交(RISH)检测piR-47851的阳性表达

采用RISH检测79对胃腺癌组织和癌旁正常组织中piR-47851的阳性表达情况。在胃腺癌组织中, piR-47851主要为阳性表达,阳性物质为棕黄色, piR-47851阳性率为72.15%(57/79), 高于邻近正常组织的阳性率15.19%(12/79), 差异有统计学意义(χ2=5.461,P=0.019)。见图2。

2.3 piR-47851的阳性表达及其临床意义

根据piR-47851的阳性表达情况,探讨其与临床资料的相关性。首先将胃腺癌病例分为阳性表达组(n=57)和阴性表达组(n=22), 结果显示, piR-47851阳性表达与肿瘤直径、分化程度密切相关(χ2=5.955、7.611,P<0.05), 而与患者性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期无相关性(P>0.05)。该结果提示piR-47851参与了胃腺癌的生长增殖过程。见表2。

表2 胃腺癌组织中piR-47851表达与临床资料的相关性[n(%)]

2.4 piR-47851表达对胃癌患者生存预后的影响

piR-47851阳性表达组中位总生存期为23个月(四分位区间为4～44个月), piR-47851阴性表达组中位总生存期为32个月(四分位区间为7～51个月)。阴性表达组总生存期长于阳性表达组,差异有统计学意义(χ2=5.864,P=0.016), 见图3。

2.5 piR-47851促进胃癌细胞的增殖活性

CCK-8实验分析piR-47851对胃腺癌细胞增殖活性的结果显示,在72 h时,过表达piR-47851后的SGC7901细胞的增殖活性为(0.89±0.05), 高于对照组的(0.72±0.04), 差异有统计学意义(t=6.425,P<0.05); 降低piR-47851表达后, SGC7901细胞的增殖活性为(0.54±0.03), 低于对照组的(0.75±0.04), 差异有统计学意义(t=4.091,P<0.05)。该结果表明piR-47851能促进胃癌细胞的增殖活性,有助于肿瘤的生长。见图4。

2.6 双荧光素酶报告实验检测piR-47851与MAPK1的关系

通过生物信息学预测piR-47851与MAPK1 3′非翻译区(UTR)有29个基因的互补结合位点(图5A), 然后在SGC7901细胞中进行了双荧光素酶报告实验。实验结果显示piR-47851与野生型MAPK13′UTR结合后能降低荧光素酶的活性,而与突变型结合却没有降低荧光素酶的活性(图5B), 说明piR-47851与MAPK13′UTR结合后能抑制MAPK1的蛋白翻译,因此MAPK1是piR-47851的下游直接靶基因。

2.7 Rescue实验佐证piR-47851对MAPK1调控及对增殖活性的影响

因为piR-47851是非编码RNA,故本研究仅能在RNA水平上通过qRT-PCR实验进行Rescue实验检测。实验共分为8组: 第1组为piRNA-NC+si-NC; 第2组为piRNA-NC+si-MAPK1; 第3组为si-piR-47851+Vector; 第4组为si-piR-47851+MAPK1; 第5组为piR-47851+MAPK1; 第6组为piR-47851+Vector; 第7组为si-piR-47851+si-NC; 第8组为si- piR-47851+si-MAPK1。Rescue实验结果表明,在改变piR-47851的表达后再改变MAPK1的表达,然后通过qRT-PCR检测MAPK1的表达水平,得到MAPK1都能受到piR-47851的调控,见图6。进一步的CCK-8增殖活性实验表明,过表达MAPK1可以增强piRNA-47851对胃腺癌细胞增殖的促进作用,而敲低MAPK1可进一步抑制胃腺癌细胞的增殖活性。见表3。

表3 Rescue实验对MAPK1和增殖活性的影响

2.8 裸鼠实验验证降低piR-47851表达对胃腺癌细胞增殖的影响

BALB/c小鼠实验分为2组,即降低piR-47851表达组(20只, 5周)和对照组(20只,5周); 每只小鼠在右侧腋腹壁的皮下接种SGC7901细胞(每200 μL含有4×106个)。每天监测裸鼠及瘤体生长情况,计算每组裸鼠移植瘤瘤体的体积均值,制作出移植瘤生长曲线。50～60 d后,麻醉处死裸鼠,取出肿瘤组织并测量体积和大小,拍照并进行后续实验。大体观察显示,降低piR-47851表达后移植瘤生长体积和质量均小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05), 见图7。细胞增殖指标Ki-67染色结果显示,降低piR-47851表达组中Ki-67阳性细胞比率为(16.9±2.4)%, 低于对照组的(79.2±6.8)%,差异有统计学意义(P<0.05),见图8。

3 讨 论

胃癌是一种起源于胃黏膜上皮和腺上皮的消化道恶性肿瘤,其发生发展涉及多种因素、多个环节,与饮食习惯、幽门螺杆菌感染和遗传等密切相关[9]。胃癌在全球范围内具有高死亡率,大多数胃癌患者确诊时已为晚期,不适合手术治疗[10]。

piRNA是一类与PIWI蛋白相互作用的RNA, 其长度为24～31 nt, 为单链非编码小RNA。piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中,通过与PIWI亚家族蛋白结合形成piRNA复合物来调控基因沉默途径[11-13]。piRNA的生物学功能包括沉默转录基因过程,调节蛋白质翻译和维持mRNA的稳定性等[14]。研究[15]表明, piRNAs在肿瘤的形成、发展和进展中起着促癌基因或抑癌基因的作用, piRNA已成为恶性肿瘤研究的热点之一。

胃癌组织中piRNA也出现了表达异常,例如在转移性胃癌患者的血液中, piR-004918、piR-019308表达水平升高,可以与CEA和CA19-9联用成为胃癌的可靠生物标记物[16]。CHENG J等[17]发现piR-651在人类胃癌组织和细胞系中表达过高,通过抑制细胞周期在G2/M期的停滞可促使胃癌细胞生长加速, piR-651有望成为胃癌的候选诊断标志物。体内和体外实验[18]发现,使用piR-823模拟物移植裸鼠皮下后可显著抑制胃癌细胞的生长和增殖。本研究发现,胃腺癌组织中piR-47851表达水平升高,说明了piR-47851作为piRNA的一员,在胃腺癌的发生发展中发挥了重要的作用和功能。

本研究RISH实验提示,胃腺癌组织中piR-47851主要在胞浆中呈阳性表达,且qRT-PCR实验显示piR-47851表达水平上调,提示piR-47851在胃腺癌的发生发展过程中起着促癌基因的作用。进一步分析piR-47851阳性表达与胃腺癌的肿瘤直径大小、分化程度和生存预后密切相关,而与患者年龄、性别、淋巴结转移和TNM分期无相关性。这一结果表明, piR-47851与胃腺癌细胞的增殖和分化有关,即piR-47851在胃腺癌中表达水平越高,肿瘤细胞分化越低,越能生长增殖,且患者预后不佳,说明piR-47851是一个促癌基因,可成为胃腺癌增殖和预后判断的生物标志物。TNM分期中的T代表原发肿瘤的大小和浸润深度,本研究结果显示piR-47851表达与胃腺癌的TNM分期无关(P=0.062), 这可能是本研究划分的肿瘤直径与TNM分期原发肿瘤大小不一致且本研究标本数量偏少有关。通过CCK-8实验证明过表达piR-47851后,细胞的增殖活性升高; 降低piR-47851表达后,细胞的增殖活性下降,提示piR-47851促进了胃腺癌细胞的增殖活性,参与了胃癌的生长过程。

piR-47851位于GenBank: DQ579 739.1, 共30个碱基序列。通过生物信息学预测MAPK1是其下游靶基因之一, piR-47851与MAPK13′非翻译区基因有互补的29个结合位点。进一步通过双荧光素酶报告实验证实piR-47851与MAPK13′非翻译区结合后,抑制了MAPK1蛋白的表达,从而得出MAPK1是piR-47851下游的直接靶基因。MAPK1是MAP激酶家族的成员之一,参与多种细胞过程,例如增殖、分化、转录调控和发育[19]。MAPK1蛋白作为一种转录抑制因子独立于其激酶活性[20]。卢燕华等[21]研究发现,胃癌细胞中MAPK1表达水平下调,抑制了癌细胞的侵袭转移,而在肺癌[22]、宫颈癌[23]中MAPK1表达水平上调,发挥促癌基因的作用。本研究表明,胃腺癌组织中MAPK1表达水平下调,发挥抑癌基因的作用。Rescue实验显示, MAPK1都会受到piR-47851的调控,也说明了piR-47851/MAPK1信号通路参与胃腺癌细胞的增殖过程。在裸鼠体内移植瘤实验中,降低piR-47851表达后肿瘤生长缓慢,体积减小,瘤体质量也较轻。对移植瘤组织检测增殖指标Ki-67时发现,降低piR-47851表达组中Ki-67阳性比率显著低于对照组,进一步验证了piR-47851发挥促癌基因的作用。

综上所述, piR-47851在胃腺癌组织中表达水平上调,与肿瘤的直径大小和预后密切相关; 在胃腺癌细胞中, piR-47851直接靶向MAPK13′UTR区域,抑制MAPK1的表达而促进胃腺癌细胞的增殖生长。