长链非编码RNA SLCO4A1-AS1靶向微小RNA-615-5p对食管癌细胞增殖、凋亡和炎症因子表达的影响

卡比努尔·阿里马斯, 陈海林, 艾山江·木合塔尔, 麦麦提热夏提·苏帕吉,吴春平, 安尼瓦尔·买买提

(新疆喀什地区第一人民医院/中山大学附属喀什医院 胸外科, 新疆 喀什, 844000)

食管癌是癌症死亡的第6大原因,男性发病率显著高于女性[1-2]。尽管已有手术、化放疗等有效治疗方法,但晚期患者生存率仍低于20%[3]。长链非编码RNA(LncRNA)是长度超过200个核苷酸且缺乏蛋白质编码功能的独立转录物,其可直接与微小RNA(miRNA)结合,抑制miRNA的功能,影响miRNA靶基因,LncRNA和miRNA参与调节细胞增殖和凋亡、生长发育、器官生长、免疫防御和炎症等多种生理过程,其异常表达会导致多种癌症发生[4-5]。LncRNA溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员4A1反义RNA1(SLCO4A1-AS1)在结直肠癌、膀胱癌中的表达增加,其高表达与不良预后和肿瘤转移密切相关,下调LncRNA SLCO4A1-AS1能够显著减弱癌细胞增殖和转移潜能[6-7]。然而, LncRNA SLCO4A1-AS1在食管癌中具体功能尚不清楚。微小RNA(miR)-615-5p是食管鳞癌的抑制因子,下调与晚期肿瘤淋巴结转移、阳性淋巴结转移和中差分化显著相关,高表达miR-615-5p可抑制食管鳞癌细胞的转移能力[8]。生物信息学分析显示, miR-615-5p与LncRNA SLCO4A1-AS1序列存在结合位点,但LncRNA SLCO4A1-AS1靶向miR-615-5p在食管癌发生发展中的作用仍有待验证。本研究旨在确定LncRNA SLCO4A1-AS1靶向miR-615-5p调控食管癌细胞增殖、凋亡和炎症因子表达的分子机制。

1 材料与方法

1.1 食管癌组织和细胞系

选取2020年7月—2022年12月接受手术切除的58例食管癌患者为研究对象,其中男38例,女20例,年龄46～73岁,平均年龄57.6岁。术中切除食管癌组织,取距离食管癌组织2 cm以上的癌旁组织作为对照。所有组织样本均在-80 ℃冰箱中保存待用。所有入组患者均知情同意,本研究经医院伦理委员会批准。人正常食管上皮细胞(HEEC)以及食管癌细胞系(Eca109、KYSE450、YES2)购自美国ATCC。

1.2 主要试剂

Revert Aid第一链cDNA合成试剂盒购自美国Fermentas公司; SYBR-Green PCR Master Mix购自美国ABI公司; 重组荧光素酶报告载体、si-RNA、pcDNA、miRNA模拟物、miRNA抑制物购自南京金斯瑞生物公司; CCK-8检测试剂盒购自北京安必奇生物公司; 细胞凋亡检测试剂盒(膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素-碘化丙啶双染)购自北京百奥莱博生物公司; 人白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒、人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA法检测试剂盒购自广东体必康生物科技; TRIzol试剂、山羊抗兔IgG(A0208)、Cleaved-caspase-3抗体(AC033)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体(AF5003)购自上海碧云天生物公司。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测LncRNA SLCO4A1-AS1、miR-615-5p表达

用TRIzol试剂分离总RNA。用Revert Aid第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录,并用SYBR-Green PCR Master Mix进行RT-qPCR。用2-ΔΔCt公式计算LncRNA和miRNA相对表达量。

1.4 细胞培养和分组

人食管上皮细胞(HEEC)以及食管癌细胞系(Eca109、KYSE450、YES2)均采用补充1%青链霉素混合液、10%胎牛血清的细胞培养基(DMEM)培养液在37 ℃、含5%CO2培养箱中孵育。将对数期Eca109细胞接种在6孔板中培养,当细胞生长达到60%融合时用Lipo3000瞬时转染。根据转染序列或质粒不同分为si-NC组、si-LncRNA SLCO4A1-AS1组、miR-NC组、miR-615-5p组、pcDNA组、pcDNA-LncRNA SLCO4A1-AS1组、si-LncRNA SLCO4A1-AS1+anti-miR-NC组、si-LncRNA SLCO4A1-AS1+anti-miR-615-5p组。未转染细胞纳入对照(NC)组。收集转染48 h细胞进行RT-qPCR以检测LncRNA SLCO4A1-AS1或miR-615-5p表达情况。

1.5 CCK-8法检测细胞活力

将转染细胞以5×103个/孔接种到96孔板, 37 ℃培养48 h, 将10 μL CCK-8 溶液加入每个孔中,并在37 ℃下孵育2 h。然后,酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)。

1.6 细胞克隆形成数检测

取对数生长期细胞,备好6孔板,每孔均接种100个细胞,完成操作后培养14 d, 之后应用甲醇进行固定,持续15 min, 应用结晶紫进行染色,持续30 min, 在低倍光学显微镜下观察>50个细胞的集落并进行计数。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

用1×结合缓冲液重悬转染48 h Eca109细胞,然后取5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和5 μL碘化丙啶加到500 μL细胞悬液中避光染色15 min。流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.8 ELISA检测培养液中IL-6和TNF-α水平

转染48 h收集细胞培养上清液,按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6和TNF-α表达水平。

1.9 双荧光素酶报告实验

合成含有野生型(WT)或突变(MUT)的miR-615-5p结合位点的LncRNA SLCO4A1-AS1序列,并克隆到pmirGLO报告载体构建重组载体LncRNA SLCO4A1-AS1-WT、LncRNA SLCO4A1-AS1-MUT。采用Lipo3000将重组载体分别与miR-615-5p模拟物或miR-NC共转染Eca109细胞,应用双荧光素酶报告基因分析系统测定荧光素酶活性。

1.10 Western blot检测Cleaved-caspase-3蛋白表达

向转染48 h的Eca109细胞中加入RIPA缓冲液于冰上裂解以提取总蛋白, 10 000转/min离心10 min, 小心收集上清液。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白样本,将分离的蛋白条带转移到聚偏二氟乙烯膜上。室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h; 然后将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。第2天,室温下将膜与二抗孵育2 h。增强化学发光法显色, Image J软件用于检测Cleaved-caspase-3条带相对灰度值。

1.11 统计学分析

2 结 果

2.1 食管癌组织中LncRNA SLCO4A1-AS1和miR-615-5p表达情况

食管癌组织中LncRNA SLCO4A1-AS1的相对表达量高于癌旁组织, miR-615-5p的相对表达量低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05), 见图1。

2.2 食管癌细胞系中LncRNA SLCO4A1-AS1和miR-615-5p表达情况

与NEC细胞比较,食管癌细胞系(Eca109、KYSE450、YES2)中LncRNA SLCO4A1-AS1相对表达量升高, miR-615-5p表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05), 见图2。本研究后续选择Eca109细胞进行功能分析。

2.3 抑制LncRNA SLCO4A1-AS1表达对Eca109细胞增殖、凋亡和炎症因子表达的影响

与si-NC组比较,si-LncRNA SLCO4A1-AS1组Eca109细胞LncRNA SLCO4A1-AS1表达量、细胞活力、细胞克隆形成数量以及培养液中IL-6和TNF-α水平降低,Cleaved-caspase-3蛋白水平和凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05), 见图3和表1。

表1 抑制LncRNA SLCO4A1-AS1表达对Eca109细胞增殖、凋亡和炎症因子表达的影响

2.4 过表达miR-615-5p对Eca109细胞增殖、凋亡和炎症因子表达的影响

与miR-NC组比较,miR-615-5p组Eca109细胞中miR-615-5p表达量、Cleaved-caspase-3蛋白水平、凋亡率升高,细胞活力、细胞克隆形成数量、培养液中IL-6和TNF-α水平降低,差异有统计学意义(P<0.05), 见图4和表2。

表2 过表达miR-615-5p对Eca109细胞增殖、凋亡和炎症因子表达的影响

2.5 LncRNA SLCO4A1-AS1靶向miR-615-5p

Starbase预测显示, LncRNA SLCO4A1-AS1与miR-615-5p序列存在结合位点,见图5。LncRNA SLCO4A1-AS1-WT和miR-615-5p模拟物共转染组细胞相对荧光素酶活性低于LncRNA SLCO4A1-AS1-WT和miR-NC共转染组[(0.42±0.04)、(1.00±0.11),t=14.866,P<0.05]; LncRNA SLCO4A1-AS1-MUT和miR-615-5p模拟物共转染组细胞相对荧光素酶活性与LncRNA SLCO4A1-AS1-MUT和miR-NC共转染组比较,差异无统计学意义[(0.98±0.08)、(1.00±0.10),t=0.469,P=0.646]。pcDNA-LncRNA SLCO4A1-AS1组细胞中LncRNA SLCO4A1-AS1表达量高于pcDNA组, miR-615-5p表达量低于pcDNA组,差异有统计学意义(P<0.05); si-LncRNA SLCO4A1-AS1组细胞中LncRNA SLCO4A1-AS1表达量低于si-NC组, miR-615-5p表达量高于si-NC组,差异有统计学意义(P<0.05), 见图6。

2.6 抑制miR-615-5p表达可逆转LncRNA SLCO4A1-AS1低表达对Eca109增殖、凋亡和炎症因子表达的影响

与si-LncRNA SLCO4A1-AS1+anti-miR-NC比较,si-LncRNA SLCO4A1-AS1+ anti-miR-615-5p组Eca109细胞中miR-615-5p表达量、Cleaved-caspase-3蛋白水平、凋亡率降低,细胞活力、细胞克隆形成数量、培养液中IL-6和TNF-α水平升高,差异有统计学意义(P<0.05), 见图7和表3。

表3 抑制miR-615-5p表达可逆转LncRNA SLCO4A1-AS1低表达对Eca109增殖、凋亡和炎症因子表达的影响

3 讨 论

研究[9-10]表明, LncRNA SLCO4A1-AS1表达失调与肺癌、结肠癌进展过程密切相关。WEI Y X等[11]报道显示,肺腺癌组织中LncRNA SLCO4A1-AS1表达增加,其高表达促进肺腺癌细胞增殖、迁移和顺铂耐药。MAO J P等[12]证实,抑制LncRNA SLCO4A1-AS1可诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡,抑制细胞增殖。TANG R等[13]研究表明, LncRNA SLCO4A1-AS1高表达对结直肠癌细胞增殖和转移具有促进功能。本研究发现, LncRNA SLCO4A1-AS1在食管癌组织、细胞系中显著上调。选择LncRNA SLCO4A1-AS1表达水平较高的Eca109细胞进行功能缺失实验,结果显示,抑制LncRNA SLCO4A1-AS1表达能够降低Eca109细胞活力,增高细胞凋亡率,并伴随着凋亡执行因子Cleaved-caspase-3表达上调,表明LncRNA SLCO4A1-AS1在食管癌中具有致癌作用。在食管癌中慢性炎症导致IL-6/STAT3、NF-κB等促炎信号通路的激活,促进肿瘤细胞增殖和存活,诱导血管生成和肿瘤细胞侵袭,促进肿瘤发生[14-15]。本研究发现,抑制LncRNA SLCO4A1-AS1表达能够降低培养液中IL-6和TNF-α水平,表明抑制LncRNA SLCO4A1-AS1表达可抑制食管癌细胞的炎症反应。

据报道, LncRNA SLCO4A1-AS1主要作为miRNA的抑制剂来调控肿瘤进展,例如LncRNA SLCO4A1-AS1通过下调miR-149表达水平加速胃癌的生长和转移[16]; LncRNA SLCO4A1-AS1在结直肠癌中的抗增殖作用与抑制miR-508-3p表达有关[17]。本研究证实, miR-615-5p是LncRNA SLCO4A1-AS1的直接靶点。miR-615-5p已被确定在多种肿瘤中表达下调,表达上调对肿瘤生长具有抑制作用[18-19], 例如circPUM1通过下调miR-615-5p表达促进卵巢癌肿瘤形成和转移[20]。miR-615-5p通过下调癌基因TRAF4水平来抑制非小细胞肺癌细胞增殖[21]。此外, miR-615-5p对食管鳞癌细胞的恶性行为和谷氨酰胺代谢具有抑制作用[22]。本研究发现, miR-615-5p在食管癌组织、细胞系中下调,过表达miR-615-5p可抑制细胞活力,降低培养液中IL-6和TNF-α水平,促进Cleaved-caspase-3表达和细胞凋亡,证实miR-615-5p在食管癌中的抑制功能。由于miR-615-5p的表达受到LncRNA SLCO4A1-AS1的负性调控,且抑制LncRNA SLCO4A1-AS1和过表达miR-615-5p的抗肿瘤作用类似,食管癌中可能存在LncRNA SLCO4A1-AS1/miR-615-5p轴。研究显示,抑制miR-615-5p表达显著削弱LncRNA SLCO4A1-AS1低表达对Eca109细胞活力、凋亡以及炎症因子表达的影响,表明LncRNA SLCO4A1-AS1通过调控miR-615-5p在食管癌细胞增殖、凋亡和炎症因子表达中发挥关键作用。

综上所述, LncRNA SLCO4A1-AS1能够促进食管癌的进展,抑制LncRNA SLCO4A1-AS1能够减少食管癌细胞的增殖和炎症因子的表达,诱导细胞凋亡,表明靶向抑制LncRNA SLCO4A1-AS1/miR-615-5p轴可能是食管癌治疗的新策略。