健脑增智饮对AD 细胞模型的神经保护作用及对细胞凋亡的影响

杨玲 翁旭亮 曾婷 王成银 刘青 邱铃铃 雷源

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病［1］。临床上以记忆障碍、计算力下降、理解力下降、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍及人格和行为改变等全面认知功能下降表现为特征。世界卫生组织报道, 预计到2050 年, AD 患病人数将高达1.52 亿, 为目前全球五大死因之一［2］, 给社会和家庭带来了极大的经济和社会负担。随着人口老龄化现象越来越严重,延缓AD 的发展及预防AD 的发生已成为目前关注的焦点问题。AD 的病理特征主要表现为由β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)沉积引起的老年斑(senile plaque, SP)、神经细胞tau 蛋白过度磷酸化引起的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)和神经元的丢失［3］。其中Aβ 在脑内异常增多聚集产生神经毒性是AD 的始动与中心环节［4］。健脑增智饮是广州医科大学附属中医医院脑病科的科内膏方制剂, 课题组在前期的临床研究中发现, 其对认知功能障碍有着明显的改善作用, 可显著改善认知障碍患者的记忆力、认知功能及日常生活能力, 改善血清S100 蛋白和AchE 指标［5,6］, 但其具体的作用机制尚未开展基础实验研究。临床仍需更进一步的研究以阐明其对AD 认知功能障碍的具体调控机制, 为其进一步的临床应用提供充分的科学理论依据。本研究拟采用Aβ1-42 构建AD 细胞模型, 通过检测AD 细胞模型的细胞活性及凋亡水平, 进一步探讨健脑增智饮治疗AD 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 健脑增智饮的制备 健脑增智饮(组方：熟地黄20 g, 茯苓15 g, 巴戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉、麦冬、石菖蒲、远志、川芎、丹参、赤芍各10 g, 五味子、生姜、大枣各6 g)复方内含的所有药材均由广州医科大学附属中医医院中药房提供, 采用自动循环煎药机提取浓缩, 调整为等渗溶液后按照生物剂量使终浓度为0.5 g/ml, 经过滤除菌后4℃避光保存, 待用前用培养液稀释至所需浓度。

1.2 细胞培养及分组 将PC12 细胞于90%DMEM+10%胎牛血清+1%双抗的培养液中, 置于37℃、95%空气+5%CO2的培养箱中培养, 1～2 d 更换培养液, 培养至单层细胞汇合后传代。将对数生长的PC12 细胞,以105个/孔铺板至6 孔培养板中, 分为六组：①NC组；②AD 组, 加入浓度为20 μmol/L 的Aβ1-42 置培养箱中24 h；③AD+Donepezil 组, 加入20 μmol/L 多奈哌齐(Donepezil)稀释液预处理PC12 细胞24 h, 再加入20 μmol/L 的Aβ1-42 作用于PC12 细胞24 h；④AD+5 μg/ml 健脑增智饮组、AD+10 μg/ml 健脑增智饮组、AD+20 μg/ml 健脑增智饮组, 应用不同浓度的健脑增智饮(5、10、20 μg/ml)预处理神经细胞24 h, 再加入20 μmol/L 的Aβ1-42 作用于PC12 细胞24 h。

1.3 CCK-8 检测法检测细胞活性 96 孔板加入细胞100 μl/孔(约1×104), 置37℃含5%CO2细胞培养箱培养24 h。加入适当浓度的受试化合物。将96 孔板在37℃, 含5%CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育1、2、3 d, 向各孔中加入10 μl 的CCK-8 检测溶液, 37℃下孵育1 h。读数前在摇床上混匀, 酶标仪在450 nm 波长处检测每孔的吸光度。

1.4 western 蛋白印迹法检测凋亡因子相关蛋白水平 常规流程胰酶消化细胞, 离心, 50 μl RIPA+5 μl PMSF 裂解液裂解各组细胞, 完成总蛋白提取, 按50 体积BCA 试剂加1 体积Cu 试剂(50∶1)配成BCA工作液测定蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳分离, 转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜, 取出杂交膜, TBST 漂洗5 min, 1 次,用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h, TBST 洗膜10 min,1 次, 加合适的一抗稀释液4℃过夜, TBST 洗膜10 min,3次, 加相应二抗稀释液37℃孵育1 h, TBST洗膜10 min,3 次, 将杂交膜置于一透明塑料板上, 用一干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面, 并使反应持续5 min, 用试剂盒提供的滤纸吸去膜表面多余的底物溶液, 放至保鲜膜上, 显影。检测各组细胞中Bax、Bcl-2 蛋白表达水平。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 取Falcon 试管,并按标本顺序编号, 使用冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞2 次, 再用1×Binding Buffer 缓冲液制成1×106细胞/ml的悬液。Falcon 试管中加入100 μl 细胞悬液, 分别加入5 μl Annexin V-FITC与10 μl 碘化丙啶(PI), 充分混匀,室温(20～25℃)避光处放置15 min。各试验管中分别加入1×Binding Buffer 缓冲液400 μl。1 h 内用流式细胞仪测定结果。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t 检验P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健脑增智饮对AD 细胞活性的影响 通过CCK-8检测法测定各组细胞活性结果显示：与NC 组比较,AD 组活性显著降低(P＜0.05), 与AD 组比较, AD+Donepezil 组、AD+20 μg/ml 健脑增智饮组细胞活性显著增高(P＜0.05)。见表1, 图1。

图1 不同浓度健脑增智饮对AD 细胞活性的影响

表1 不同时间各组PC12 细胞活性比较( x-±s, n=3)

2.2 健脑增智饮对AD 细胞中Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响 通过western 蛋白印迹法测定凋亡因子相关蛋白表达水平结果显示：与NC 组比较, AD 组Bax 表达水平显著上调, Bcl-2 水平显著下调, Bcl-2/Bax 显著下调(P＜0.05)；与AD 组比较, AD+Donepezil 组、AD+10 μg/ml健脑增智饮组、AD+20 μg/ml 健脑增智饮组Bax 水平显著下调(P＜0.05), AD+Donepezil 组和AD+20 μg/ml 健脑增智饮组Bcl-2/Bax 显著上调(P＜0.05)。见表2, 图2。

图2 不同浓度健脑增智饮对AD 细胞中Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响

表2 不同浓度健脑增智饮对AD 细胞中Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响( x-±s, n=3)

2.3 健脑增智饮对AD 细胞凋亡的影响 应用流式细胞仪测定细胞凋亡情况结果显示：与NC 组比较,AD 组细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)；与AD 组比较,AD+Donepezil 组和AD+5 μg/ml 健脑增智饮组、AD+10 μg/ml 健脑增智饮组、AD+20 μg/ml 健脑增智饮组细胞凋亡显著降低(P＜0.05)。见表3, 图3。

图3 不同浓度健脑增智饮对AD 细胞凋亡的影响

表3 不同浓度健脑增智饮对AD 细胞凋亡的影响( ±s, n=3)

表3 不同浓度健脑增智饮对AD 细胞凋亡的影响( ±s, n=3)

注：与AD 组比较, aP＜0.05

项目NC 组AD 组AD+Donepezil 组AD+健脑增智饮组5 μg/ml10 μg/ml20 μg/ml凋亡率7.870±0.241a36.530±1.42910.690±1.257a26.930±1.790a23.800±1.136a10.410±1.903a

3 讨论

关于AD 的治疗, 目前临床尚无特效药物, 西医方面主要包括胆碱酯酶抑制剂, 如多奈哌齐(唯一一种同时被美国食品与药品管理局和英国药品控制局批准上市的用于对症治疗轻、中度AD 的药物)、石杉碱甲、加兰他敏等, 另一类为N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA 受体)拮抗剂, 如美金刚等。尽管目前有多种上市的治疗药物, 但仅能延缓疾病的进展, 而难以治愈及阻止本病的进展, 新的治疗策略亟待被发现。

Aβ 是一种由淀粉样前体蛋白通过γ 分泌酶和β 分泌酶通过剪切而成, 越来越多的研究表明, Aβ在AD 发病机制中起关键作用, 是涉及遗传和环境因素的AD 发病机制的上游分子, 而Aβ 积累及其相关炎症被认为是AD 脑中神经变性和神经元丢失前的早期事件［4］。研究证实神经元细胞内Aβ 的过度沉积明显早于临床症状的出现［7］。Aβ 的毒性积聚能够导致SP 的形成, 引起神经元细胞的死亡、突触缺失和神经功能的失调, 导致AD 的发生。其中神经元细胞的凋亡是AD 重要的病理改变, 神经元细胞凋亡通路主要包括2 条：线粒体依赖的凋亡通路和死亡受体依赖通路, Aβ 主要通过线粒体通路导致神经元细胞的凋亡, Caspase-3 是凋亡执行的关键因子, Aβ 破坏线粒体膜结构, 细胞色素C 释放至胞质中, 进一步激活caspase-3, 导致细胞凋亡［8］。

本研究以Aβ1-42 诱导PC12 细胞培养成AD 细胞模型, 利用不同浓度健脑增智饮对AD 细胞模型进行干预结果显示：与NC 组比较, AD 组活性显著降低(P＜0.05), 与AD 组比较, AD+Donepezil 组增殖活性显著增高(P＜0.05), AD+20 μg/ml 健脑增智饮组细胞活性亦显著增高(P＜0.05)。进一步证实健脑增智饮对AD 细胞模型有较好的神经保护作用, 减少AD 细胞的凋亡, 且高浓度(20 μg/ml)健脑增智饮治疗AD 组疗效更优。上述结果表明, 健脑增智饮可明显增加细胞活性, 抑制Aβ 蛋白诱导的细胞凋亡, 减少神经元丢失。

Bax 属于兔抗人单克隆抗体, 是人体最主要的凋亡相关蛋白, Bax 的过度表达可促进线粒体内膜孔道蛋白线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放, 释放细胞色素C,激活caspase-9, 进一步激活caspase-3 介导的线粒体凋亡途径, 促使细胞发生凋亡。而Bcl-2 蛋白是线粒体凋亡的关键蛋白, 可阻断、抑制线粒体内膜孔道蛋白MPTP 开放, 阻断caspase-3 蛋白激活, 从而阻断、抑制细胞凋亡。Bax 是与Bcl-2 同源的水溶性相关蛋白, 可拮抗Bcl-2 的保护效应, 促进细胞的凋亡［9-14］。本研究应用western 蛋白印迹法检测相关凋亡蛋白的表达结果显示：与NC 组比较, AD 组Bax 表达水平显著上调, Bcl-2 水平显著下调, Bcl-2/Bax 显著下调(P＜0.05)；与AD 组比较, AD+Donepezil 组、AD+10 μg/ml健脑增智饮组、AD+20 μg/ml 健脑增智饮组Bax 水平显著下调(P＜0.05), AD+Donepezil 组和AD+20 μg/ml 健脑增智饮组Bcl-2/Bax 显著上调(P＜0.05)。提示AD 组的细胞凋亡增加, 而多奈哌齐和健脑增智饮高浓度可有效减少细胞凋亡的发生, 进一步证实了健脑增智饮通过调控Bcl-2/Bax 的表达对AD 细胞减少细胞的凋亡,起到神经保护作用。

AD 属于中国传统医学“痴呆”范畴, 最早见于东汉《华佗神医秘传·华佗治痴呆神方》。殷贺等［15］多名医家均认为“肾虚、痰、瘀”的基本病机贯穿于AD发生发展的始终。年老肾精虚衰, 肾藏精, 精生髓, 髓源亏乏, 髓海不充, 同时脾胃渐衰, 运化无力, 气机失调, 湿浊内聚, 郁而成痰, 痰浊内盛, 上蒙清窍, 脑失清灵, 而气机失调, 气血瘀滞, 脑络血脉运行不畅, 瘀血阻滞, 清窍失养, 导致脑神经功能障碍, 发为本病。治疗上多以“补肾化痰祛瘀法”贯穿始终［16-19］。基于此基础, 本课题组成员也总结出治疗AD 的经验方健脑增智饮, 本方以地黄饮子为基础方加减, 重用熟地黄、山茱萸, 起到以补肾填精益髓为主, 余药共用, 兼以化痰开窍、活血祛瘀, 标本同治、虚实兼施的作用, 长期应用于临床, 并取得较好疗效。

综上所述, 健脑增智饮可通过调控Bcl-2/Bax 蛋白的表达, 有效减少AD 细胞的凋亡, 提高细胞的活性,起到对AD 细胞的神经保护作用, 且高浓度(20 μg/ml)健脑增智饮治疗组疗效更优, 为中医治疗认知障碍疾病的进一步探索提供理论及临床依据。