肠道微生物与炎症性肠病靶标发现和检测
2024-02-29郑雪松张小飞
郑雪松，张小飞，董 碟
武汉贝茵莱生物科技有限公司，湖北 武汉 430000
炎症性肠病是一类复杂、病因不明的慢性肠道疾病，主要类型为克罗恩病和溃疡性结肠炎。这两种疾病都表现为反复发作的肠道炎症，严重影响患者的生活质量。肠道微生物群落拥有巨大的生物多样性，与宿主的健康状况存在密切关联，且近年来已被证明在许多疾病的发生与发展中起着重要作用，包括肠道疾病、肠道相关的代谢性疾病和一些心脑血管疾病等[1-2]。葡聚糖硫酸钠盐（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS）是一种聚阴离子衍生物，其诱导结肠炎模型的机制虽未十分明确，但通常认为会引发巨噬细胞功能失调、肠道菌群失调。IFX 和Hydrostatin-SN10 在炎症性肠病治疗中显示出较好的疗效[3-4]。因此，研究利用DSS 对小鼠进行溃疡性结肠炎诱导，观察对照组、实验组和治疗组溃疡性结肠炎小鼠的体重变化、脾脏指数及生物标志物的表达情况，分析小鼠的炎症标志物表达水平与炎症性肠病的关系，有助于诊断IBD 和指导用药治疗。
1 资料和方法
1.1 一般资料
研究采用的实验动物为C57BL/6 小鼠，实验主要耗材包括DSS、组织固定液、生理盐水、苏木素伊红染色试剂盒、Chymotrypsin C 和Gelsolin ELISA 试剂盒、RhoGDI2 抗体等。实验使用的主要仪器包括制冰机、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、超微量分光光度计、组织研磨仪、酶标仪、TS-200 脱色摇床、超纯水仪、GeL Image System。
1.2 研究方法
溃疡性结肠炎小鼠模型的构建步骤如下。第一，将C57BL/6 小鼠进行3～5 d 的预饲养，再随机分为7 个组，每组6～8 只小鼠，包括对照组，实验组，IFX和Hydrostatin-SN10 治疗处理组。第二，对照组以灭菌的纯净水及无菌饲料喂养，持续7 d[5-6]；其他组以3%DSS 溶液喂养，持续7 d。第三，Hydrostatin-SN10处理组小鼠均进行腹腔注射给药，IFX 组、Hydrostatin-SN10、M1、M2 和M3 组的给药剂量分别是800 μg/kg/d、4 mg/kg/d、800 μg /kg/d，实验组注射100 μL/20g/d 的生理盐水7 d。第四，每日定时对每组小鼠称重并进行行为观察，记录小鼠的体重。第五，实验第7 天处死小鼠，取出小鼠的脾脏、结肠进行拍照并记录其重量[7]，然后按照部位分段处理结肠，分别用于炎症标志物的检测和后续其他实验材料。
1.3 观察指标
溃疡性结肠炎的症状一般表现为腹泻、患者体重下降、脾脏异常肿大[8]。因此，探究肠病微生物在炎症肠病中的靶标时，将小鼠的体重变化、脾脏质量及肠道炎症标志物的表达情况作为观察指标进行分析，Chymotrypsin C 及Gelsolin 均采用ELISA 试剂盒进行检测，RhoGDI2 采用免疫印迹法进行检测。
1.4 统计学方法
研究对实验结果数据的统计学分析均采用SPSS 25.0 进行，值均为双侧检验，若P＞0.05，则数据不具有统计学意义，反之则具有统计学意义。实验数据均采用表示，计量资料间的比较采用ANOVA检验。
2 结果
2.1 各组小鼠的体重结果分析
对各组小鼠进行处理后，对照组小鼠体重呈正常生长状态，实验组小鼠体重呈大幅下降状态，治疗组均有不同程度的体重下降（P＜0.001）。开始实验的第1 天，所有小鼠的体重为19±1.0 g，分别在第1、3和7 天进行称重，小鼠体重变化见表1。
表1 小鼠体重变化结果
2.2 各组小鼠的脾脏指数结果分析
相较于实验组，其余组别的脾脏指数均有所下降（P＜0.001）。相较于对照组，实验组小鼠的脾脏指数上升0.100%，IFX 组和Hydrostatin-SN10 治疗组小鼠的脾脏质量上升0.056%；小鼠脾脏质量变化结果见图1。
图1 小鼠脾脏指数变化结果
2.2 小鼠炎症标志物表达结果分析
相较于对照组，实验组的三种炎症标志物表达量均大幅上升，经过不同药物治疗后，小鼠肠道炎症标志物表达水平出现不同程度的下降。Hydrostatin-SN10-M1 组的炎症因子表达水平下降不明显，且与Hydrostatin-SN10 组相比，具有显著的统计学差异，Chymotrypsin C （P ＜0.001）、RhoGDI2 （P ＜0.001）、Gelsolin（P＜0.001）。小鼠肠道炎症标志物表达水平结果见表2。
表2 小鼠肠道炎症标志物表达水平
3 讨论
IBD 是一种非常经典的与肠道微生物菌群相关的疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。研究以C57BL/6 小鼠为实验对象，分析了小鼠治疗前后的体重、脾脏和炎症标志物表达水平与IBD 之间的联系，为IBD 治疗靶标的发现及检测提供相关实验资料。
实验组的小鼠肠道组织中三种生物标志物表达量均上升，其中实验组RhoGDI2 基因表达水平上升最明显，是对照组的82 倍，实验组Gelsolin 和Chymotrypsin C 分别是35 倍和8.9 倍。经过IFX 和Hydrostatin-SN10 治疗组的肠道炎症标志物表达水平均有明显下降。综上所述，小鼠结肠中Chymotrypsin C、RhoGDI2 及凝溶胶蛋白Gelsolin 表达水平与小鼠溃疡性结肠炎的严重程度密切相关，未来可能作为诊断指标用于IBD 的检测和治疗。
