植物乳杆菌AR307 发酵培养基优化研究

衡利冰，夏永军，艾连中，刘欣欣

上海理工大学健康科学与工程学院/上海食品微生物工程技术研究中心，上海 200093

乳酸菌能够用于生产酸乳、乳酪、风味泡菜、发酵饮料等具有保健功能的食品。植物乳杆菌作为一种常见乳酸菌，因其抗衰老、减轻肠道生态平衡[1]等功能而愈发受消费者重视与喜爱了[2]。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为乳杆菌科乳杆菌属，不产芽孢、兼性厌氧或厌氧、可用于食品加工产业的革兰氏阳性菌，形状为直杆状或弯杆状[3]，是一种重要的益生菌，具有调节动物胃肠道菌群平衡、改善肠道内环境、增强免疫力和抵抗力等多种功能[4-6]。近年来，植物乳杆菌开始被应用于泡菜、豆腐等产品的发酵中，有益于人体健康，已成为国内外的研究热点之一。

目前，有关益生菌的研究日渐增多，但将其应用于大规模工业化生产中仍具有一定的局限性。植物乳杆菌培养基优化研究快速发展，但其工业化应用仍处于起步阶段。工业上常以MRS 培养基为发酵培养基，一些学者研究了添加缓冲盐和化学中和剂以促进乳酸菌生长的方法[7]。Choi GH 等[8]用OFAT 法筛选碳源、氮源等，通过响应面实验得到菌株生物量为3.845 g/L，为优化培养基的2.429 倍。Chen H 等[9]通过优化碳源、氮源、有效因子等，得知磷酸氢二钾为促生长因子，各物质的添加量为葡萄糖21 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉8 g/L，酵母浸出粉8 g/L，磷酸氢二钾3.5 g/L，CH3COONa 6.5 g/L，C6H14O7N22 g/L，MgSO40.2 g/L，吐温80 1 mL/L 时，最大活菌数可以达到2.72×109CFU/mL。孙雨佳等通过单因素、爬坡实验与中心组合实验确定了植物乳杆菌NCU137 最佳培养基的成分为麦芽糖26.73 g/L，酵母浸粉21.8 g/L，大豆蛋白胨16.59 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L，MnSO4·H2O 0.06 g/L，腺嘌呤0.13 g/L，苯丙氨酸0.051 g/L，吐温80 为1 mL/L，最终活菌数高达9.2×109CFU/mL。植物乳杆菌AR307 是上海理工大学食品微生物工程技术研究中心实验室从四川泡菜中筛获的一种乳酸菌，具有降血糖、抑制肿瘤、抑制α-淀粉酶等作用。根据植物乳杆菌AR307 的生长需求，调整MRS 培养基碳源、氮源、无机盐的含量进行单因素实验、Box-Behnken 试验，旨在提高植物乳杆菌AR307 的菌体密度，为AR307 产业化、工业化大剂量发酵提供理论依据[10]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌AR307，由上海理工大学食品微生物工程技术研究中心保藏；

MRS 培养基：酪蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸镁0.1 g/L，乙酸钠8.3 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，吐温80 1 mL/L;

MRS 固体培养基：在液体培养基的基础上加入20.0 g/L 的琼脂；

果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、低聚木糖、木糖、海藻糖、壳寡糖、淀粉、抗性糊精、菊粉、胰蛋白胨。

PL2002 型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；SW-CJ-1D 型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；酶标仪，奥地利美谷分子；DU-800 分光光度计，Beckman 公司；Ruskinn 低氧厌氧培养工作站，英国Ruskinn；BPH-G082 型精密恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪，芬兰Oy Growth Curves Ab 公司；LDZX-50KBS 型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.2 菌株培养

将于-80 ℃保藏的植物乳杆菌AR307 在固体MRS 培养基上划线培养，在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h 后，挑取单菌落于液体MRS 培养基中，于37 ℃恒温培养箱中培养16～18 h 后，以1%的比例接种于优化培养基中培养。

1.3 发酵培养基优化

分别选择不同的碳源、氮源、无机盐作为影响菌株活性的主要因素，通过单因素试验选择影响因素与水平。

1.3.1 最佳碳源的确定

在MRS 培养基中分别加入2%的果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、低聚木糖、木糖、海藻糖、壳聚、淀粉、抗性糊精、菊粉、葡萄糖，研究不同种类的碳源对植物乳杆菌AR307 生长的影响，筛选出最佳碳源后选择不同浓度的碳源加入MRS，研究碳源浓度对菌株的影响，菌株接种量均为1%，37 ℃培养24 h，生长曲线仪测定菌体的OD600。

1.3.2 最佳氮源的确定

在MRS 培养基中分别添加酵母浸粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨，研究不同氮源对植物乳杆菌AR307 生长的影响，又研究了复配氮源及不同浓度的氮源对菌株生长的影响，菌株接种量均为1%，37 ℃培养24 h，生长曲线仪测定菌体的OD600。

1.3.3 无机盐的确定

在MRS 培养基中分别加入磷酸氢二钾、七水硫酸镁、三水乙酸钠、柠檬酸氢二铵，研究不同无机盐对植物乳杆菌AR307 生长的影响，又研究了复配无机盐及不同浓度的无机盐对菌株生长的影响，菌株接种量均为1%，37 ℃培养24 h，生长曲线仪测定菌体的OD600。

1.4 BOX-Behnken 响应面实验

响应面设计（Box-Behnken）原理，选取对植物乳杆菌AR307 生长影响较大的单因素碳源、氮源、无机盐为自变量，以OD600（分光光度计）为响应值，得到其在各个影响因素下的最大值，设计响应面实验，以确定植物乳杆菌AR307 生长的培养基成分，实验因素与水平设计见表1。

表1 实验因素和水平设计表

2 结果与分析

2.1 碳源对菌株生长的影响

碳源作为微生物生长过程中重要的营养物质，可以为乳酸菌生长提供能量，加快物质向细胞的传输速度，加快细胞的合成和新陈代谢，促进乳酸菌的快速增殖[11]。不同碳源对植物乳杆菌AR307 生长与产生的影响如图1（a）所示，在以麦芽糖为碳源时，AR307 生长最快，OD600在培养至12 h 时达到1.6，这与董子兴等[12]的研究结果一致，菌株对壳聚糖、木糖、淀粉、抗性糊精等的利用率较低，几乎不生长，因此确定麦芽糖为最佳碳源。接下来，对麦芽糖的添加量进行探究，如图1（b）所示，结果发现随着添加量的增加，菌体密度逐渐增加，在麦芽糖浓度为3%后呈下降趋势，这可能由于碳源浓度过高，抑制了植物乳杆菌AR307 的生长，最终选取2.5%、3%、3.5%作为响应面的三个浓度。

图1 不同碳源优化的生长曲线图

2.2 氮源对菌株生长的影响

氮源作为微生物生长的重要营养素，主要用于蛋白质、氨基酸、核酸和辅酶等物质的合成[13]。蛋白胨含有丰富的氨基酸，特别是含硫氨基酸较多，还含有细菌生长所需的维生素和其他生长因子，是各种培养基制备的基础原材料，主要作用是提供氮源。本研究将MRS 培养基中的氮源替换为酵母浸粉、牛肉浸出粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨及复合氮源，发酵24 h，测定其生长曲线，探究不同氮源对植物乳杆菌生长的影响。如图2（a）所示，添加单一氮源酵母浸粉、牛肉浸出粉、酪蛋白胨的效果与添加复合氮源的效果存在一定的差异，例如单纯添加胰蛋白胨可以抑制菌株生长，但复合氮源可以促进菌体生长，因此考虑对几种氮源进行复配使用，既可以满足菌体生长的需求，又可以降低成本，取得更好的效果[14]。当酵母浸粉、牛肉浸出粉、酪蛋白胨的添加比例为1∶1∶1 时最有利于植物乳杆菌生长。接下来，对复合氮源的添加量进行探究，结果如图2（b）所示，随着氮源添加量的增加，菌体密度逐渐增加，当氮源添加量为1.5%时，菌体密度达到1.63；但当添加量超过1.5%时，菌体密度降低。这可能是由于植物乳杆菌在生长过程中需要足够的氮源，浓度较低营养不充分会影响其生长，但浓度过高又会使有机酸不断积累从而抑制菌株生长，最终选取1.5%、2%、2.5%作为响应面的三个浓度。

图2 不同氮源优化的生长曲线图

2.3 无机盐对菌株生长的影响

乳酸菌高密度培养过程补充的无机盐主要是作为缓冲物质，来调节菌体生长过程中pH 的变化的，维持适宜乳酸菌生长的pH 环境，延长发酵剂的活性[11]。磷酸盐在培养基中具有调节pH 和缓冲等作用，在MRS 培养基中添加相同比例的单一无机盐或复合无机盐，考察不同缓冲盐对菌株生长的影响，以菌株生长OD600值的大小为标准，如图3（a）所示，选用磷酸氢二钾时菌体密度最大，最终确定无机离子为磷酸氢二钾。进一步对磷酸氢二钾的添加量进行了浓度试验，结果显示随着添加量的增加，菌体密度呈现先上升后下降的趋势如下图3（b），最终选取0.7%、0.8%、0.9%三个浓度开展响应面实验。

图3 不同无机盐优化的生长曲线图

2.4 响应面优化试验

根据单因素试验的结果，以碳源添加量、氮源添加量、无机盐添加量为影响因素，以OD600为响应值，进行三因素三水平的响应面分析，进一步优化培养基的添加比例。选取三因素的Box-Behnken 拟合二阶响应面三水平设计，共17 个试验点，其中12 个为分析因子，5 个为零点，响应值Y 为OD600，试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

对响应面设计表进行多元二次回归拟合，建立OD600的回归模型如图表3 所示。回归方程Y=6.2+0.39X1+0.088X2+0.1X3-0.23X1X2+0.1X1X3+0.1X2X3-0.54X12-0.29X22-0.71X32，其中A、A2与C2为极显著差异（P＜0.01）。模型拟合的决定系数（R2）和校正决定系数（RAdj值）分别为0.907 2 和0.787 9，C.V.%为5.29＜10，说明该实验的可信度和精确度较高，模型的P＜0.01，具有显著性，失拟项P 值为0.051 1，不显著（P＞0.05），表明模型的显著性较好，各因素对植物乳杆菌AR307 的影响次序为碳源＞无机盐＞氮源，其中碳源的影响最大[15]。

表3 回归模型的方差分析及显著性检验

图4 是回归方程得到的曲面与等高线图，主要反映了碳源、氮源与无机盐之间的相互作用，碳源与无机盐对菌株OD600的交互效应较强，表现为响应曲面较为陡峭；碳源与氮源对菌株OD600的交互作用次之；氮源与无机盐对菌株OD600的交互效应较差，表现为响应曲面较为平缓。由方程可知，二项式系数为负值，表明方程拥有最大值。利用Design-Expert10.0 分析计算，最适发酵培养基为碳源添加3.5%、氮源添加2.21%、无机盐添加0.75%，此时的OD600值最大为6.4。

图4 各因素交互作用对AR307 菌株OD600 的影响曲面和等高线

3 结论

本研究对植物乳杆菌AR307 发酵培养基的组成成分及添加量进行了优化，以单因素实验与响应面Box-Behnken 实验建立了二次多项式回归模型。单因素试验确定促进菌株生长的最优碳源为麦芽糖、氮源为复合氮源、无机盐为磷酸氢二钾，由回归方程的拟合结果得知菌株生长的最佳碳源添加量为3.5%、氮源添加量为2.21%、无机盐添加量为0.75%，确定了植物乳杆菌AR307 的最适培养基。在此优化条件下，植物乳杆菌AR307 的OD600值为6.4，菌体密度得到了提升，植物乳杆菌发酵培养基优化的研究为今后工业化生产植物乳杆菌奠定了基础，具有较好的经济效益、社会效益和发展前景。