单细胞测序技术在发育与育种研究的新进展

耿肖涵

福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117

1 单细胞测序技术

以第二代、第三代为主要研究的基础：混合细胞测序（Bulk cell Sequencing）技术，是一项检测细胞群体信息的整体技术，无法准确定位到每一细胞的具体变化[1]。于是，单细胞技术随之诞生。单细胞测序技术是从细胞水平上对生物体的细胞遗传物质进行扩增与测序。

2 单细胞分离与获取

目前，获取单细胞的技术种类较多，其中有限稀释技术（Limited dilution technology）和显微分离操作技术（Micromanipulator technology），在组织学与个体发育的研究中发挥重要的作用。但随着计算机的引入，上述两种技术的使用率已经下降。激光显微切割（Laser capture microdissection，LCM）是在显微镜下发射高激光，利用细胞群与转运膜紧密结合而特异性地捕获细胞，从而获得一定范围内同种来源的细胞。荧光激活细胞分选（Fluorescence activated cell sorting，FACS）是在流式细胞技术的基础上，使用光学系统对具有可识别抗体的细胞进行定位，将异质性的细胞收集到不同的装置中，此技术准确度高、通量高。微流控技术（Microfluidics）是在细胞级尺度下对细胞流体进行操控，在小体积封闭系统内将细胞分离，是生物学、计算机、物理学等多学科交叉形成的技术，因其操作简单、成本与技术难度低、样品消耗小、获得效率高和通量高等多项优点而被广泛应用[2]。

3 单细胞测序类型

由于细胞类群与研究目的的不同，研究者需要从不同角度与层面揭示细胞类群的差异，这就要求使用不同的手段进行实验研究。其中，单细胞测序包括单细胞全基因组测序（Whole -genome amplification，WGA）、单细胞转录组测序（Single cell RNA sequencing, scRNA-seq）、单细胞表观组测序（Single cell epigenome sequencing）和单细胞多组学研究（single cell multi-omics sequencing）。这些不同的测序技术基本上可以满足目前对生物组织和细胞生命的研究。

3.1 单细胞全基因组测序

WGA 技术常用来证明细胞类群的不同，分析单个细胞的点突变位置与其他基因突变，可以精准地获取单细胞的突变来源及基因突变的频率，解释类细胞在生命体内的功能、细胞类群演化及发育过程，可以准确地测出细胞的全部遗传物质，但难以有效获取高保真的细胞基因扩增产物。WGA 技术是研究细胞遗传信息最为基础的一个手段，所延伸的方法类型也相对较多，包括简并寡核苷酸引物PCR（Degenerate Oligonucleotide -Primed Polymerase Chain Reaction ，DOP-PCR），原理是在引物的3’末端插入6 bp 的随机核酸序列，与细胞遗传物质结合[3]；多位点置换扩增（Multiple Displacement Amplification ，MDA）使用phi29DNA 聚合酶，在体系中与外源性的六聚体发生结合，反应可以得到50～100 kb 大小的DNA 片段。除此之外，在MDA 技术的基础上与传统的PCR 技术结合形成MALBACs（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycle），原理是利用碱基的简并性，设计特异性的引物片段与DNA 模板结合，在DNA 链置换酶的环境下进行体外扩增，在3’端产生具有特异性标记的中间产物，随后在新一轮的扩增中，于5’端产生与3’端互补的末端，在一轮扩增结束后单链成环，最终不断扩增得到产物。

3.2 单细胞转录组测序

scRNA-seq 指从组织器官或生物体液中分离出细胞，进行高精度、无偏差、高分辨率的转录组测序，获得信息并建库，最终对整个细胞的数据进行分析[4]。单细胞转录组测序技术在生殖系统、组织器官发育、动物育种，以及神经系统、肿瘤生物等多个领域被广泛运用。

3.2.1 生殖系统发育研究

单细胞转录组测序最早应用于对生殖系统的研究，主要包括生殖腺体与生殖细胞，同时也包括受精卵细胞，但迄今为止仍然有较多的结论需要被证实。研究人员对小鼠的新生雌性胎鼠（P0.5）卵巢中单个生殖细胞进行RNA-seq 分析，建立卵母细胞发育的整体通路。

3.2.2 组织、器官发育研究

Seow 等人利用单细胞转录组测序分析了5 种不同类型的肝细胞的近30 万个单细胞，从而确定COVID-19 在肝脏中的入侵类型，报道COVID-19在进入肝脏组织后，TROP2+肝祖细胞的一系列症状与反应。Jia 等人[5]利用单细胞组测序技术检测分离出糖尿病成年小鼠肾脏中肾小球细胞，并实时关注和记录动态变化。同时测定多种类型的肾脏细胞，验证肾小球细胞的特异性基因，也发现多个肾小球的内在标志基因。scRNA-seq 技术在肾脏中的大量研究，推动了人类疾病模型的建模和损伤系统修复研究的进程，对现今的研究有着重要的意义[6]。

3.2.3 神经系统方面

Lake 等人[7]针对人脑的特异性结构，对微流体单细胞核测序技术（snDrop-seq）及单细胞转座体超敏性位点测序技术（scTHS-seq）进行技术革新，并对人大脑中的视觉皮层细胞群和额叶皮层细胞群进行细胞分析，鲜明地展示了组成人脑不同位置的细胞的共同点和差异，其中包括转录因子与多种转录元件，同时将人脑不同的细胞群与相关疾病相互映射，为人脑的相关疾病提供依据。

3.2.4 动物育种方面

种公畜在种群的遗传性状与种群优势中发挥着较大的作用。因此，需要对种公畜的生殖能力与精子以及生殖器官的质量进行特别关注。在公畜的生殖组织上进行单细胞测序，以对其发育过程和生殖细胞发生的机制进行探究，这对选取高价值、高产能的畜种具有较为关键的作用。高源等[8]利用scRNA-seq技术对性功能发育完成前、后的牛睾丸细胞群进行测序，并通过差异分析，把牛睾丸分为12 个差异类群，其中有9 类体细胞与3 类生殖细胞，同时筛查出牛睾丸的特异性基因，如Ccl21、Esx1 和Gas1 等。

4 展望

单细胞多组学测序是目前展示生物体发育的关键技术，从多维度、多层面直接反映细胞的基本特性。相比传统的组织学、肿瘤等领域，目前单细胞测序技术在畜牧科学、物种培育与转基因物种的筛查中的应用相对较少，这也是未来发展不可忽视的一个部分。

对于细胞的生命历程及异质性细胞在生物发展的不同阶段所承担的功能的研究正处于快速发展时期。随着技术的创新和进步，计算机与更多学科相融。要想决定哪种测序技术最有利于实现研究目标，应更多地分析不同测序技术与测序平台的优缺点。获得单细胞信息的方法没有“一刀切”的标准，每种技术都有优点和局限性。目前，用于冷冻或固定标本的样品处理方法，或用于单细胞转录组的原位或体内分析的技术模式亟待开发。