cfDNA 研究现状及分析前变量浅析

彭宏威，刘南，张姗姗，邹聪，钱开宇

循环游离 DNA（circulating free DNA，cfDNA）是在外周血中发现的游离于细胞外的 DNA[1]。1977 年，Leon 等[2]用放射免疫测定法发现肿瘤患者血清中 cfDNA 含量水平明显高于健康人群，现已证实它广泛存在于人体血液、尿液、脑脊液、胸腹水、卵泡液、唾液等各类体液中[3-4]。cfDNA 是核小体凋亡 DNA 在细胞内循环核酸酶的作用下天然断裂形成的平均长度为 180 ～ 200 bp 的小片段[5]，作为分子标志物具有获取简单、无创、信息量大等得天独厚的优点，在无创产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）、肿瘤诊断及监测、器官移植监测、糖尿病、自身免疫性疾病等领域均具有大量的研究[6-7]。目前 cfDNA 的检测方法主要有PCR 和二代测序（next-generation sequencing，NGS），其原理和优缺点各不相同，需结合研究目的及分析前变量来选择合适的方法。

cfDNA 分析前各种因素均会影响其质量，这严重阻碍了 cfDNA 在众多领域内的临床推广应用。建立一套 cfDNA标准检测前处理流程（pre-analytical procedures，PAP）是cfDNA 检测实现临床广泛应用的关键。本文集中讨论cfDNA 研究现状及影响其质量的各种检测前变量，以期为cfDNA 建立标准 PAP 以及为临床检测的应用提供参考。

1 cfDNA 研究现状

cfDNA 主要类型有细胞核源性 DNA（nuclear cfDNA，ncfDNA）与线粒体源性 DNA（mitochondrial cfDNA，mtcfDNA）[8]。cfDNA 的产生机制目前不是完全清楚，现普遍认为是活细胞的主动释放或凋亡与坏死细胞的被动释放产生的[9]。人体 cfDNA 含量受肥胖、运动及肿瘤等多种因素影响[10-11]。在健康人外周血中 cfDNA 含量均值约为30 ng/ml[12]，几乎都来自凋亡或坏死细胞，肿瘤患者体内的cfDNA 则更多来源于肿瘤细胞及邻近非肿瘤细胞的凋亡[13]。

目前 cfDNA 的检测主要有 PCR 和 NGS 两种方法，近年来基于这两种方法衍生出许多更加高效灵敏的检测方法。随着检测灵敏度和精确度的不断提高，PCR 技术现已发展为实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、数字 PCR（digital PCR，dPCR）和微滴式数字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）等多种检测技术。NGS 是目前公认检测 cfDNA 最有效的分析方法，具有灵敏度高、通量大的优点。cfDNA 的评估指标因检测目的或样本类型的不同而有所差异，主要有 cfDNA 浓度、纯度、片段长度、片段完整性等基本指标[14-15]。Shen 等[16]以血浆 cfDNA 为模板，qPCR 定量检测 ALU247 和 ALU115 片段的浓度，ALU247/ALU115 比率来评估 cfDNA 的完整性，发现多发性骨髓瘤患者血浆 cfDNA 水平显著升高，ALU247 片段浓度与多种临床特征显著相关。此外，肿瘤的研究中还会借助肿瘤细胞释放 cfDNA 进入体液的特点来测定 cfDNA 基因位点突变[17]、拷贝数变化[18]等指标或甲基化情况[19]。

无创、成本低、灵敏度高、取样简单、特异性强一直是临床诊断标志物的选择标准。目前，从 cfDNA 中获取的生物信息在 NIPT 和癌症等方面已有广泛的应用。在 NIPT领域，cfDNA 检测主要用于识别胎儿染色体异常的遗传疾病和性别鉴定等。Zhu 等[20]通过高通量测序分析了一个NIPT 病例，有效评估了分别来源于骨髓移植和供体卵子体外受精的 cfDNA 的遗传相关性，为非侵入性产前亲子鉴定提供了一种新的方法。肿瘤发病隐匿，发展周期长，如何在影像学未检查出肿瘤灶前就提示肿瘤存在是医学界有待攻破的难题。cfDNA 检测较影像学灵敏度更高且无创、无辐射，使其在肿瘤领域备受关注。cfDNA 既可以作为生物标志物检测肿瘤基因异质性[21]，还能作为辅助组织活检的新方法用于肿瘤诊断、治疗后监测及耐药性检测[22-23]。饮食暴露诱导脂肪细胞凋亡也会导致 cfDNA 释放，来自 cfDNA的信息可提前预测 2 型糖尿病的发展[6]。在器官移植中供体来源的 cfDNA 可作为分子标记来评估排斥反应后的同种异体移植物损伤[24]。cfDNA 在自身免疫性疾病中作为疾病进展和治疗反应预测的生物标志物也发挥着重要作用[25]。

目前，虽然 cfDNA 已被报道在众多领域内广泛应用，但普遍存在的问题是分析前的各种变量描述不全或不明确，且在大多领域内依然停留在初期研究阶段，尚未实现临床推广应用。Shen 等[16]在分析 cfDNA 水平和完整性与多发性骨髓瘤患者临床特征之间的相关性时，描述了采集的血液在4 ℃ 下保存及 8 h 内进行处理，未描述样本在长时间缓冲处理期间是否还经历过常温转运等可能影响样本质量的因素。Wolf-Doty 等[24]通过检测同种异体器官移植受体血液中供体来源的 cfDNA 来评估排斥反应后的移植物损伤情况，没有明确描述血液采集量、处理时限、cfDNA 提取相关信息等分析前变量，这使分析结果缺乏可靠性，也不利于方法的验证及研究成果的临床应用。

2 规范 cfDNA 检测分析前变量的意义

cfDNA 在 NIPT 领域内已得到权威验证且具有广泛的临床应用，但目前可供参考的 NIPT 分析前数据非常有限[7]。cfDNA 在其他临床领域内研究非常广泛，但尚未达到常规临床诊断广泛推广应用的水平，原因之一是 cfDNA分析前阶段缺乏标准 PAP。刁振丽等[26]专门探讨了宏基因组下一代测序（mNGS）用于全国 80 个实验室检测血液样本中微生物 cfDNA 的质量保证问题，调查了样本分析前、分析中、分析后和进行性能验证的情况，结果发现各实验室mNGS 工作流程差别很大，需要积极优化工作流程来确保及时准确的检测结果。Luo 等[27]为探究不同采血管对血浆cfDNA 和 NIPT 质量控制的影响，比较了保存在 EDTA、ImproGene 和 Streck 试管中的血液样本溶血、cfDNA 浓度和片段分布情况，最后发现 ImproGene 管性能最为优良。尿液 cfDNA 除血液 cfDNA 通过肾脏滤过外，还来源于肾、膀胱等泌尿器官细胞的释放，故在泌尿系统肿瘤患者体内含量明显高于健康人群。尿液量大且易收集，是研究泌尿系统肿瘤的理想样本[28]。然而，尿液 cfDNA 的成功应用却相对较少，很重要的原因是尿液样本 cfDNA 浓度低且容易降解，同时缺乏标准的 PAP。

样本质量是确保转化研究成果可重复性的决定性因素之一。样本采集、转运、预处理、提取及保存等过程中许多因素（表 1）均会影响分析前 cfDNA 的样本质量。当前面临的最主要的问题有：①cfDNA 容易受基因组 DNA 的污染[30]，且在体外不稳定，易发生降解，即使在采集时使用 EDTA 保护液并及时处理样本，也可能会因为捐赠者身体状况原因或样本转运条件等多种不易控制的因素叠加而导致 cfDNA 受到污染或降解[29,38]；②cfDNA 浓度低且片段小，而 cfDNA 用于分析检测前需要经过复杂繁多的步骤，该过程极易发生 cfDNA 的含量损失或关键片段丢失[33]；③cfDNA 的检测与定量方法多样，其准确性相互之间难以确证比较。如 PCR 常通过看家基因或稳定的非编码重复序列来对 cfDNA 进行定量，qPCR 测量靶基因的 Ct 值后再用标准曲线计算 cfDNA 的量，使用不同的标准品或参考基因可能会得到差别极大的结果，另外提取过程中的样本损失也会使测定结果偏低，这些因素使同一样本 cfDNA 的不同定量结果无法比较[39]。只有对 cfDNA 分析前的各个变量及细节进行规范且统一，最终检测结果的可靠性和重复性才能得到保障，因此建立 cfDNA 的标准化 PAP 意义重大。

3 影响 cfDNA 样本质量的因素

3.1 样本采集过程

cfDNA 样本采集时捐赠者身体状况、样本类型、抗凝剂、采集容器和采集量等均会影响样本保存质量。人体主要依托血液循环进行新陈代谢，采集血液用于 cfDNA 检测研究适用面最广，其他样本来源的 cfDNA 检测研究相对较少。捐赠者身体状况主要包括年龄、是否运动、是否妊娠、疾病状况等情况，捐赠者身体状况不同，体液 cfDNA 含量不同[29]。Neuberger 等[40]研究表明运动通过影响人体免疫稳态从而引起体液中 cfDNA 含量的显著增加。Krasnyi 等[41]比较了早产女性与足月分娩女性血浆 cfDNA 和胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的含量，发现妊娠22 ～ 31 周和 32 ～ 36 周的早产女性比足月分娩女性 cfDNA含量高，妊娠 32 ～ 36 周的早产女性比足月分娩女性cffDNA 含量高。

首选血浆用于 cfDNA 的检测，血浆可避免白细胞裂解释放的基因组 DNA 影响 cfDNA 的浓度及纯度[30]，常选择含 EDTA、肝素和柠檬酸盐等抗凝剂的采血管来采集样本[42]。含不同抗凝剂的采血管样本保存效果不同，肝素会与血液中 cfDNA 形成聚合物而影响 cfDNA 提取及qPCR 效率[43]。虽有研究称含有 3.2% 柠檬酸钠采血管比K2EDTA 采血管性能更好[44]，但缺乏更多可靠的研究支撑。如果血液暂存时间不超过 4 h，则优先推荐 EDTA 采血管。由于采集血液样本后经常要跨地区运输而不能立即处理，近年来许多保存效果很好的商业专用采血管被用于 cfDNA检测目的的采集中，可使血浆 cfDNA 含量在 7 d 内保持稳定[31]。肿瘤患者血浆 cfDNA 浓度通常在 180 ng/ml 左右，循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）片段较短且含量更少，为了保证采集到足量 cfDNA 用于后续DNA 提取及人表皮生长因子受体（EGFR）突变检测，有专家共识推荐采集 10 ml 全血用于进一步分离血浆[45]。

表1 cfDNA 的分析前变量及其影响方式

目前关于尿液、脑脊液和腹水等体液 cfDNA 样本的采集研究相对较少，由于样本量大，为方便采集，大多先采用无菌容器收集好样本，得益于血液 cfDNA 样本收集的成熟经验，部分研究者会向样本中加入 EDTA 等抗凝剂。Markus等[46]使用全基因组测序来表征尿液 cfDNA 的片段模式，收集尿液后加入 0.5 mol/L EDTA 0.8 ml 并在 1 h 内进行处理。Chauhan 等[47]用 NGS 方法分析 42 例膀胱癌患者的尿液 cfDNA，在根治手术前用含有 2 ml 的 0.5 mol/L EDTA 的无菌小瓶收集尿液样本。他们都借鉴了已有的经验，特别对添加 EDTA 保护剂、缩短处理时限等关键分析前变量进行严格控制，因此能够确保肿瘤来源的尿液cfDNA 在分析前质量可控，进而得到了可靠有用的信息。

3.2 样本转运及暂存过程

样本采集至预处理前涉及到样本的转运和暂存，该过程中运输时间、温度及暂存时间是影响样本质量的主要因素。EDTA 管内的血液应在采集后 4 h 内处理，如不能及时处理，应暂存于 4 ℃ 条件下以避免基因组 DNA 的污染，但延迟处理时间最好不要超过 24 h。涉及跨地区样本采集，最好使用商业专用的 cfDNA 管来采集样本并常温运输，在7 d 内可以确保样本质量的稳定。样本转运及暂存过程中应避免发生溶血，细胞中释放的血红蛋白及其代谢产物对 Taq酶活性有抑制作用，最终会导致 PCR 扩增效率降低[38]。尿液样本暂存条件跟血液样本大致一样，脑脊液、胸腹水等样本基本是采集并处理后立即用于检测，转运及暂存过程的参考实例较少。

3.3 样本处理过程

样本处理过程非常重要，既要确保 cfDNA 提取得率，也要避免可能来自基因组 DNA 对样本的污染。离心力、离心时间等参数会影响 cfDNA 提取含量。对血液来说，为了有效减少基因组 DNA 对样本的污染，处理时推荐两步离心法，第一步使用较低离心力去除大量细胞成分，第二步使用较高离心力去除细胞残余物和细胞碎片。尿液、腹水、脑脊液和唾液等体液样本中所含细胞成分相对较少，现有研究基于不同目的或样本类型的离心处理方式各不相同，大多借鉴了血液样本处理方法，采用二次离心或一次离心方式来处理样本。Ding 等[3]在探究 cfDNA 用于非小细胞肺癌诊断的应用中，将 EDTA 管采集的外周血进行二次离心，第一次是在 4 ℃ 以 1900 ×g离心 10 min，第二次是在4 ℃ 以 16 000 ×g离心 10 min；收集的唾液样本也是采用二次离心方法进行处理，先在 300 ×g下离心 20 min，再以 10 000 ×g离心 20 min，样本在提取 DNA 前均冻存于-80 ℃。该研究血液和唾液的处理流程中，由于血液中细胞成分远比唾液复杂，处理血液的两次离心力均大于处理唾液的离心力，唾液具有一定黏性且含有泡沫，因此处理唾液的时间比血液更长。Miller 等[32]通过对脑脊液 cfDNA 测序分析验证了微创分子诊断的临床经验，用无菌 Streck 管收集脑脊液后对样本进行二次离心（1600 ×g离心10 min，3000 ×g离心 10 min）彻底去除细胞沉淀等杂物。Liu 等[48]用全基因组测序分析肿瘤来源的脑脊液 cfDNA，用无菌管收集脑脊液后对样本进行一次处理（1500 ×g离心 10 min），上清液等份分装至新的 1.5 ml Eppendorf 管中。由于研究目的不同，这两种脑脊液样本前处理参数和流程差异很大，目前脑脊液 cfDNA 研究得较少，没有可推荐的最佳样本前处理方案。

3.4 样本提取过程

cfDNA 提取效率是决定检测结果的重要步骤，但cfDNA 含量低且片段小，如何高效快捷提取 cfDNA 一直是研究的重点。目前提取 cfDNA 主要方法有异戊醇抽提法、磁珠法和亲和柱法等，大多实验室均采用商业试剂盒来提取cfDNA。商业试剂盒种类较多，其中 Qiagen 公司生产的一系列 DNA 提取商业试剂盒应用较为广泛，但该试剂盒提取纯化过程中会损失 150 bp 以下小片段而导致 cfDNA产率降低[33]。Diefenbach 等[34]比较了 6 种 cfDNA 提取试剂盒的性能，该研究首次使用添加 DNA 片段来评估商业cfDNA 试剂盒，发现基于旋转柱的 Qiagen QIAamp 循环核酸试剂盒是性能表现最稳定的试剂盒。方仲表等[35]比较了基于磁珠法的天根游离核酸提取试剂盒和基于硅胶膜吸附柱法的德国 Qiagen 循环核酸试剂盒对血浆中 cfDNA 的提取效果，采用 EGFR 突变基因检测试剂盒作为定量分析方法，发现 Qiagen 试剂盒在 cfDNA 提取浓度及纯度、EGFR 突变基因的阳性检出率和重复性方面的表现均要优于天根试剂盒。不同试剂盒所获得的 cfDNA 产率、纯度及特定片段大小等一般是不同的，且各个试剂盒的定量分析方法也不同，目前主要定量方法有试剂盒法、qPCR 及某些特定基因的拷贝数等[49]，因此很难有可推荐的对比研究结果。

3.5 样本保存过程

保存提取的 cfDNA 比保存用于提取的体液会更加稳定，保存时间、保存温度、cfDNA 提取物浓度等均会影响cfDNA 提取物样本的保存质量。Shao 等[36]系统地研究了反复冻融循环对 DNA 样品稳定性的影响，研究发现冻融循环次数的增加会加速 DNA 的降解，且大片段的 DNA 最容易降解，但增加 DNA 浓度可以减少由反复冻融循环引起的 DNA 片段降解。许多研究因实际需要保存的是初步处理后用于提取 cfDNA 的体液样本，如血浆、尿液、脑脊液等[38]。体液样本冷冻保存后超过 3 次以上的冻融循环会引起 cfDNA 片段化[37]。Clausen 等[50]研究了血浆于 -25 ℃储存 0 ～ 6 年 cffDNA 及 cfDNA 含量的变化情况，发现储存 2 ～ 3 年的血浆中可扩增的 cffDNA 和总 DNA 水平显著增加，储存 3 年后 cffDNA 部分略有下降，推测可能是随着时间的推移，DNA 中蛋白质的丢失引起了 cffDNA及 cfDNA 产量增加。Chen 等[51]研究了 cfDNA 在不同溶剂中的冻融稳定性，发现存在于血浆中或储存在提取缓冲液中的 cfDNA 冻融后回收率稳定，且 cfDNA 浓度在 4 ℃下 24 h 内保持稳定，在室温下 12 h 内保持稳定。尿液、脑脊液等体液针对 cfDNA 检测研究的保存目前报道极少，还没有形成可供参考的经验。样本处理后根据研究使用需求进行小体积多份数分装更有利于样本的保存和提高使用效率[7]，也可以减少将来样本可能存在的冻融循环。

4 总结与展望

cfDNA 是极具应用潜力的分子标志物，存在于各类体液样本中，在 NIPT 和癌症等众多领域内均具有广泛的研究或应用。前处理流程中影响 cfDNA 样本质量的因素众多且复杂，现有研究尚存在一些不足。目前绝大部分研究均是针对血液样本 cfDNA 检测前处理流程，尿液、胸腔积液、脑脊液等[48]体液样本cfDNA 检测前处理流程及方法基本是参考血液的经验或者非常简易的操作过程，还缺乏更多相关研究来形成更加精准规范的方法。有研究表明 cfDNA 甲基化受分析前因素的影响[52]进而可能会最终影响 cfDNA的分析结果，相关机制还不明确。此外，不同样本处理后常用试剂盒来提取 cfDNA，不同的试剂盒提取效率各不相同[34]，并且 cfDNA 的定量检测也有争议[39]，这些极不利于不同实验室之间的数据对比及 cfDNA 检测前处理流程的规范，试剂盒的提取效率还有待优化，相应配套的定量检测方法也有待摸索。

cfDNA 检测前处理流程的标准化是一项非常复杂的工作，仍需以下大量工作才能促进标准化 PAP 的建立：①尿液、胸腔积液、脑脊液等体液 cfDNA 检测的分析前质量控制因素需要更多可靠的比对研究来确认；②cfDNA 的提取方法需要进一步优化，开发可以避免基因组 DNA 污染且实现小片段 cfDNA 高效提取的试剂盒，针对尿液、胸腔积液、脑脊液等不同体液开发不同的专用试剂盒以获得可靠的提取得率；③在 cfDNA 的定量检测方法上，针对 PCR 定量检测方法，可以使用多内参基因分析并开发新的 cfDNA含量评估办法，经过更多研究确证后形成行业标准并推广使用，此外可以将拉曼光谱法、电化学传感器法等灵敏度更高的检测方法应用到 cfDNA 的定量检测中。

在 cfDNA 分析前处理中，研究表明部分操作可以作为建立标准化 PAP 的规范。如样本收集时添加 EDTA 保护液[46-47]和血液样本及时处理[31]对保证 cfDNA 质量至关重要。随着技术的快速发展以及越来越多研究人员参与到实际问题的解决中，cfDNA 检测前处理流程在不久的将来会更加规范，必定也会为临床诊疗做出更突出的贡献。