千里光药材功效关联物质预测研究*

蒋学青，陈彦洁，罗 鑫，谢谭芳，王志萍△

（1. 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200； 2. 广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，广西 南宁 530200）

千里光为菊科植物千里光SenecioscandensBuch. -Ham. 的地上干燥部分，广泛分布在我国陕西、湖北、四川、广西等地，有抗炎镇痛、抗肿瘤、抑菌等功效［1-4］。近年来，千里光药材的获得主要为野生来源，产地、环境气候的不同均会影响药材质量，且缺少能直观反映多批次千里光药材差异标志物的指纹图谱研究［5］。鉴于此，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法建立了千里光药材的指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析探索引起千里光药材质量差异的主要成分，同时以网络药理学分析千里光药材的功效关联物质及作用基础，以期为全面控制和评价千里光药材的质量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ML204T/02 型电子天平、XSR205DU/A 型电子天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司，精度分别为0.1 mg 和0.01 mg）；LC-2030 Plus 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；KQ - 800DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UPH -IV20TN 型优普超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

1.2 试药

绿原酸对照品、金丝桃苷对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-22111711，MUST-22071210，含量分别为99.82%，98.41%）；咖啡酸对照品、芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110885 - 201703，100080 - 201811，含量分别为99.7%，91.7%）；异槲皮苷对照品（成都麦德生科技有限公司，批号为RP200404，含量为99.18%）；异绿原酸A对照品、异绿原酸C 对照品（上海融禾医药科技发展有限公司，批号分别为211106，211128，含量均为98%）；乙腈、磷酸均为分析纯，水为超纯水。千里光药材15 批（样品信息见表1），经广西中医药大学田慧教授鉴定为正品。

表1 药材样品信息Tab.1 Information of medicinal material samples

2 方法与结果

2.1 HPLC 指纹图谱建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack GIST C18柱（250 mm×4.6 nm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min 时11%A，20～21 min 时11%A →13%A，21～65 min 时13%A →21%A，65～67 min 时21%A，67～75 min 时21%A →25%A，75～81 min 时25%A →28%A，81～90 min 时28%A →11%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：345 nm；柱温：25 ℃；进样量：10µL。

2.1.2 溶液制备

取对照品各适量，用60%甲醇溶解，制成绿原酸、咖啡酸、金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸C 质量浓度分别为0.342，0.172，0.366，0.186，0.178，0.224，0.164 mg/ mL 的混合对照品溶液。取药材样品适量，粉碎，过2 号筛，取1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再次称定质量，并用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

精密度试验：精密吸取供试品溶液（编号Q11）适量，按2.1.1项下色谱条件连续进样测定6次，以4号峰为参照峰。结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.25%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.44%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液（编号Q11）适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h 时按2.1.1 项下色谱条件进样测定，以4 号峰为参照峰。结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.41%（n= 6），相对峰面积的RSD均小于1.40%（n= 6），表明供试品溶液室温下放置24 h内较稳定。

重复性试验：取药材样品（编号Q11）适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，以4 号峰为参照峰。结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.09%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.74%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.4 特征图谱的建立及相似度评价

取15 批药材样品各适量，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）评价，以Q11 样品的HPLC 图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1 min，采用中位数法生成共有模式，多点校正和Mark峰匹配生成叠加图谱及对照图谱（见图1、图2），共确定18个共有峰，与混合对照品溶液色谱图（见图3）对比后，指认出其中7 个。15 批药材样品的指纹图谱相似度介于0.892～0.997（仅Q6 样品低于0.9），详见表2。可见，不同产地千里光药材的成分差异较小，较稳定。

图2 药材样品高效液相色谱对照指纹图谱Fig.2 HPLC reference fingerprints of medicinal material samples

图3 混合对照品溶液高效液相色谱图4.Chlorogenic acid 5.Caffeic acid 11.Rutin 12.Hyperoside 13.Isoquercetin 15.Isochlorogenic acid A 16.Isochlorogenic acid CFig.3 HPLC chromatograms of mixed reference solution

表2 样品相似度Tab.2 Similarity of samples

2.2 聚类分析

将15 批药材样品指纹图谱相对峰面积数据导入SPSS 25.0 软件进行聚类分析，结果见图4。当平方欧氏距离为10或6时，样品分别可聚为2类（S6为一类，其余为一类）或3类（S12和S15为一类，S6为一类，其余为一类）。可见，不同产地的样品存在差异，可能与环境、气候及地理位置因素有关。

图4 15批药材样品聚类树图Fig.4 Tree diagram of cluster analysis of 15 batches of medicinal material samples

2.3 主成分分析

将15 批药材样品中18 个共有峰的相对峰面积（以绿原酸峰为参照）导入SPSS 25.0 和SIMCA 14.1.0 软件，以主成分特征值和方差贡献率进行主成分分析，结果见表3、图5。共有4 个主成分被提取，累积方差贡献率为90.195%，表明能代表样品大部分信息。

图5 PCA得分图Fig.5 Scoring plot of PCA

表3 药材样品主成分特征值及方差贡献率Tab.3 Eigenvalue and variance contribution rates of principal components of medicinal material samples

主成分因子成分矩阵见表4。可知，以载荷系数的正方向值为依据，第1-4 主成分分别反映了指纹图谱中1 - 3，5，7，9，11 - 18 号峰，6，8，10 号峰，4 号峰，1 号峰的信息。提示这些成分是引起千里光药材质量和功效差异的重要因素。

表4 药材样品成分矩阵Tab.4 Component matrix of medicinal material samples

2.4 网络药理学分析

候选成分靶点预测及成分- 靶点网络构建：利用SwissTargetPredication（http：// www. swisstargetprediction.ch）、SEA（http：// sea.bkslab.org）数据库，将前述7 种成分导入，预测其靶点，删除重复靶点后共得到109 个相关靶点，利用Cytoscape 3.8.0 软件构建成分-靶点网络，详见图6。

图6 成分-靶点网络Fig.6 Network of components - targets

蛋白相互作用（PPI）网络构建：将筛选出的109 个相关靶点导入String 数据库（https：// string - db. org），设置PPI 评分＞0.4，删除游离靶点（见图7），通过Cytoscape 3.8.0 软件对PPI 网络进行拓扑分析，筛选出关键靶点18个［度（degree）值＞12.46（均值）］，详见表5。

图7 PPI网络Fig.7 PPI network

表5 关键靶点筛选结果Tab.5 Results of key targets screening

富集分析：将筛选出的18 个关键靶点导入Metascape 数据库（https：// metascape. org），以P＜0.05进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。GO 富集得条目233条，其中生物学过程（BP）197 条，细胞组成（CC）17 条，分子功能（MF）19条，以-lgP值排序，分别取显著性排前10的条目进行可视化分析，详见图8。其中BP主要涉及细胞对辐射、活性氧、紫外线（UV-A）、化学应激、光刺激、无机物质、金属离子和氧化应激的反应，以及调控miRNA 代谢过程等；CC 主要涉及膜筏、膜微域、囊泡腔、细胞投影膜、细胞前缘、前沿膜、转录调节复合体、细胞外基质、细胞质囊泡腔等；MF 主要涉及信号受体活性调节、染色体结合、酶活性调节等。KEGG富集得59条信号通路，以-lgP值排序，取排前10 的条目进行可视化分析，详见图9和表6。

图8 GO功能富集分析Fig.8 Results of GO functional enrichment analysis

图9 KEGG通路富集分析Fig.9 Results of KEGG pathway enrichment analysis

表6 靶点富集分析Tab.6 Analysis of target enrichment

成分- 靶点- 通路网络构建：利用Cytoscape 3.8.0 软件构建成分-靶点-通路网络，详见图10。采用Network Analysis 功能对网络进行分析，发现JUN，FOS，MMP - 9，EGFR 的degree 值较高，肿瘤信号通路、内分泌耐药通路与核心靶点关系密切。

图10 成分-靶点-通路网络Fig.10 Network of components - targets - pathways

3 讨论

预试验中在制备供试品溶液时，考察了不同提取方式（超声、回流），不同提取溶剂（40%，60%，75%，100%甲醇），不同提取时间（20，30，40，50，60 min）对提取效果的影响，发现样品经60%甲醇回流提取1 h，其色谱峰数目丰富，整体峰形较好。同时对乙腈- 水、甲醇-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液这3个流动相体系进行考察，发现以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时的基线稳定，各峰分离效果较好，故选择。

中药成分复杂多样，具有多成分、多靶点、整体性等特点，其质量是保证临床疗效的关键［6］。2020 年版《中国药典（一部）》仅将金丝桃苷作为千里光药材质量评价指标，缺乏多指标成分评价［7］。鉴于此，本研究中对千里光药材化学成分进了表征，建立了15 批药材样品的HPLC 指纹图谱，相似度均较高，并确定了18 个共有峰，指认出其中7 个成分。通过聚类分析和主成分分析得到了影响药材质量和导致功效差异的活性成分。

文献研究发现，千里光药材的主要活性成分为黄酮类成分（如芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷等，具有抗炎、抗肿瘤等作用）［8-11］及酚酸类成分（如绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸C 等，具有抗氧化、抑菌作用）［12-13］。网络药理学分析结果显示，7 种活性成分通过调控EGFR，ESR1，JUN，MMP - 9 等关键靶点作用于肿瘤信号通路、内分泌耐药通路、松弛素信号通路等关键信号通路。EGFR 是跨膜受体激酶家族HER/ ERB - B 成员之一，主要参与细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等环节，但EGFR 过度表达会导致细胞分裂、生长失控，与肿瘤细胞的形成和发展密切相关［14-15］。ESR1是核受体蛋白超家族重要成员，可与雌激素结合调节机体产生相应生物学效应。有研究表明，ESR1的表达与机体细菌感染状态有关［16-17］。

综上所述，本研究中通过建立千里光药材的HPLC指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析、网络药理学研究初步预测，与EGFR，ESR1，JUN，MMP-9等关键靶点有关的咖啡酸、异槲皮苷、金丝桃苷可能为千里光药材发挥抗肿瘤和抑菌等作用的功效关联物质。