外源氨基酸对废弃烟草水热液相香味产物的影响

岳先领，刘克强，关体青，聂红资，朱鑫超，梁 淼，张峻松，姜 涛

（1.黑龙江烟草工业有限责任公司，黑龙江哈尔滨 150028；2.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450001）

0 引言

烟草作为特殊的经济作物在我国种植广泛，其主要是被卷烟企业收购用于烟草制品生产，但在烟草的生产及加工过程中会不可避免地产生较多的废次或不适用烟叶[1-3]。这些不适用烟叶的产生不仅耗用企业库存，影响企业烟叶库存循环和经济效益，同时也是一种生物质资源的浪费[4-7]。围绕不适用烟叶的资源化、价值化利用问题，国内外学者开展了广泛研究，目前对低、废次烟叶应用问题已有诸多研究，如用于制备再造烟叶、分离提取有效活性物质等[8-10]，为缓解资源浪费提供了方法。

近年来，利用水热反应技术处理废弃生物质是一种将其转化为水热焦及功能化学品的有效途径，具有反应可控性好、样品无需复杂预处理等优点[11-13]。Cai J 等人[14]利用水热手段将烟草秸秆转化为热值较高的生物炭燃料；朱克明，刘灿等人[15-16]针对云南烟叶和秸秆原料，采用水热法以乙醇为反应溶剂，经水热液相产物萃取分离后获取致香物质，这些研究为以废弃烟草为底物的水热反应香料制备提供了思路。

水热反应条件下烟草溶出物间的美拉德反应是致香物质生成的主要因素之一，而通过外加氨基酸增加反应底物浓度，有望提升烟草水热反应香料产率和香韵丰富性。基于此，以废次烟叶为原料，在外加脯氨酸和丙氨酸的条件下，考查外加氨基酸对烟草水热反应液相产物的影响，为废弃烟叶经水热反应技术制备香料提供参考与借鉴。

1 试验部分

1.1 材料、试剂与仪器

材料与试剂：低次烟叶样品（牡丹江，CSMA，2018），黑龙江烟草工业有限责任公司提供；脯氨酸、丙氨酸（分析纯），上海麦克林生化科技有限公司提供；乙酸苯酯（纯度＞99%），北京百灵威科技有限公司提供；二氯甲烷（色谱纯），北京迪科马科技有限公司提供；超纯水，实验室自制。

仪器：水热合成反应釜，规格50 mL，北京星德仪器设备有限公司产品；DHG-9145A 型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；SHZ-D 型循环水式多用真空泵，郑州利研仪器设备有限公司产品；8890/5977B 型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草基水热液相产物的制备

将烟叶样品粉碎，准确称取2.00 g 样品于盛水的反应釜中，料液比为1∶10，分别添加0.20 g 脯氨酸或丙氨酸，以不添加氨基酸组为对照样品，反应釜加盖密封，放入分别设定好温度的电热鼓风干燥箱中（温度分别为低温140 ℃，高温220 ℃），水热反应时间设定为2 h。

共设置6 个试验组，分别编号为140-O（反应温度140 ℃，无氨基酸引入）、140-P（反应温度140 ℃，脯氨酸引入）、140-A（反应温度140 ℃，丙氨酸引入）、220-O（反应温度220 ℃，无氨基酸引入）、220-P（反应温度220 ℃，脯氨酸引入）、220-A（反应温度220 ℃，丙氨酸引入）制备烟草水热液相产物，考查不同水热温度下，氨基酸引入对烟叶水热液相香味产物的影响。

1.2.2 液相产物的检测分析

采用半定量法定量，利用气相色谱-质谱联用仪对浓缩后烟叶水热反应的液相香味产物进行检测分析，明确液相产物组成及含量。

（1）内标溶液的配置。准确称取0.25 g（精确至0.000 1）乙酸苯乙酯于1 000 mL 容量瓶中，以二氯甲烷为溶剂，定容至刻度，摇匀，配置成质量浓度为0.25 mg/mL 的乙酸苯乙酯内标溶液。

（2）产物的分离浓缩。待反应釜冷却至室温，将反应产物用三角抽滤漏斗抽滤（必要时可离心后抽滤），得液相产物。将液相产物转移至250 mL 分液漏斗中，加入20 mL 二氯甲烷进行萃取，重复3 次，合并萃取液。

向萃取液中加入1 mL 内标溶液，于60 ℃条件下加热浓缩至1 mL，过0.45 μm 有机过滤膜，待上样分析。

1.2.3 GC-MS 分析条件

色谱柱：HP-5MS 毛细管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度280 ℃，载气为He，载气流速1 mL/min，分流比为15∶1，升温程序50 ℃保持5 min，以3 ℃/min 的速率升至280 ℃保持15 min，传输线温度280 ℃，电离方式为EI，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描方式为全扫描，扫描范围为50～550 amu。

2 结果与分析

2.1 烟草水热液相产物挥发性成分分析

烟草水热反应液相产物总离子流图见图1，烟草水热反应液相产物种类个数变化见图2。

图1 烟草水热反应液相产物总离子流图

图2 烟草水热反应液相产物种类个数变化

由图1 和图2 可知，不同反应条件下共检测出包括酮类、醛类、醇类、杂环类等在内的81 种挥发性成分。试验组140-O，140-P，140-A，220-O，220-P，220-A 中分别检测出12，9，15，38，47，48 种。

烟草水热液相产物主要挥发性成分分析结果见表1。

表1 烟草水热液相产物主要挥发性成分分析结果

由表1 可知，反应温度为140 ℃时，3 个试验组（即140-O，140-P，140-A）所得产物挥发性成分种类相对较少，共有18 种，其中无氨基酸引入时有12 种，脯氨酸引入时有10 种，丙氨酸引入时为14 种。3-甲基环戊烷-1,2-二酮、糠醛、糠醇、9-羟基-4,7 -巨豆二烯-3 -酮等为其共有成分，前三者均为美拉德反应产物，后者更可能源于烟草自身香味物质的溶出。有研究表明[17]，3 -甲基环戊烷-1,2 -二酮可能由美拉德反应高级阶段发生的2,3 -烯醇化反应产生，而糠醛、糠醇则通过1,2 -烯醇化反应产生。3 -甲基环戊烷-1,2 -二酮具有枫槭香、焦糖样的甜香及坚果类香气，含量分别为13.09，43.52，10.45 μg/g；糠醇及糠醛类物质则具有似焦糖、烘烤和甜香、面包香气，其含量分别为35.01，135.38，32.77 μg/g。

水热反应温度为220 ℃时，3 个试验组中共检测出76 种有效物质，试验组220-O，220-P，220-A中分别检测出38，46，48 种挥发性成分，较140 ℃分别增加了26，36，34 种。其中共有物质19 种，相对于140 ℃，该反应温度下新产生物质11 种，包括甲基环戊烯醇酮（MCP）、乙基环戊烯醇酮（ECP）、麦芽醇、3 -甲基吡啶等麦拉德反应产物[18]，以及苯酚、愈创木酚和异烟碱等。其中，酚类物质可能源于原料中木质素的降解[19]，异烟碱则是烟碱的降解产物。液相产物中的MCP 和ECP 具有类似坚果和枫槭样的焦甜香味，220-O，220-P，220-A 反应条件下的含量分别为78.29，160.17，581.59 μg/g 和151.30，195.57，227.81 μg/g；麦芽醇则具有特征性的甜香气息，各试验组中含量分别为151.30，195.57，227.81 μg/g；愈创木酚具有明显的烟熏与辛香，其含量为77.68，89.79，93.42 μg/g。

除上述较为典型的香味物质外，液相产物中香味物质中间体2,3 -二氢-3,5 二羟基-6 -甲基-4（H）-吡喃-4 -酮（DDMP）仅在140 ℃时可检测到，可能是温度较高时使其发生了降解。烟草特有物质烟碱在各试验组产物中均被检出，且其含量随着温度升高而增大，可能与较高温度促进了烟碱的溶出有关。

2.2 不同种类及代表性香味成分变化分析

2.2.1 不同种类香味物质变化

将表1 中液相香味成分进行分类，对比分析反应温度和外加氨基酸对各类香味成分变化的影响。

各试验组烟草水热液相各种类产物含量见图3。

图3 各试验组烟草水热液相各种类产物含量

液相产物中酮类香味物质在140 ℃时含量较低，其中外加脯氨酸和丙氨酸能够增加酮类物质生成，由表1 可知，酮类物质多为环酮，外加脯氨酸和丙氨酸后酮类物质含量分别为377.72，241.84 μg/g。水热反应温度为220 ℃时，酮类物质含量显著增加，平均含量为1 722.71 μg/g，平均增幅为632.82%，表明温度是影响酮类物质生成的主要因素，且氨基酸种类对酮类物质含量有一定促进作用，各温度下均以脯氨基酸引入时的酮类物质含量最高，其原因可能与木糖和脯氨酸共裂解机制类似[20]，脯氨酸的催化作用使得多糖类物质裂解反应所需活化能降低，促进了随后的美拉德反应和酮类物质的产生。

反应温度为140 ℃时，液相产物中几乎无酚类物质产生，至220 ℃时始有酚类物质产生。外加脯氨酸和丙氨酸后酚类物质含量分别为322.01，308.36 μg/g，与空白组相比，其含量分别增加了36.44%和30.66%。表明温度对酚类物质的产生有较大影响，氨基酸引入一定程度上也促进了酚类物质的产生。这可能与酚类物质产生的来源有关[21]，水热反应中酚类物质主要由木质素在亚临界水中逐渐降解产生，随温度升高和反应时间延长，木质素降解越完全，使酚类物质含量增加。

杂环类香味物质在140 ℃时几乎不产生，外加脯氨酸和丙氨酸后分别产生了少量2 -甲基吡嗪和2,5 -二甲基吡嗪。当反应温度提高至220 ℃，杂环类产物含量均明显增加，空白试验组220-O 从无至有增加了444.60 μg/g，外加脯氨酸和丙氨酸后分别增加了526.83 和1354.21 μg/g。这表明温度的升高对杂环类产物的产生有较大影响，而氨基酸种类也会影响杂环类物质含量。其中，引入丙氨酸后杂环物质含量大大高于引入脯氨酸，主要为吡嗪类物质的大量增加，Amrani Hemaimi M 等人[22]的研究证实丙氨酸是吡嗪类物质的前体。Rizz G P[23]也认为α -氨基酸（丙氨酸为α -氨基丙酸），与酮类物质通过Strecker 降解，可产生吡嗪类物质。

综合来看，反应温度的提高与氨基酸的引入均能提高烟草水热液相产物的含量，升高反应温度可明显增加各类产物含量，尤其是酮类、酚类与杂环类物质。脯氨酸引入主要增加产物中环酮类物质含量，同时胺类物质如N,N -二乙基苯胺含量明显增加。丙氨酸引入主要提升了产物中杂环尤其是吡嗪类物质的含量，产生了2,5 -二甲基吡嗪、2,3 -二甲基吡嗪、2,3,5 -三甲基吡嗪等一系列吡嗪环物质。

2.2.2 代表性香味成分变化

以液相产物中香味物质的含量和香韵特征为依据，筛选12 种代表性香味成分，进一步分析了水热反应温度和外加氨基酸对其含量变化的影响。

代表性水热液相产物含量变化见图4。

图4 代表性水热液相产物含量变化

酮类物质中，MCP 仅在高温反应条件下产生，3 -甲基环戊烷-1,2 -二酮在140 ℃时含量最低仅为43.52 μg/g，至220 ℃含量最高为629.43 μg/g，随温度升高，吡啶吡咯酮平均含量从15.40 μg/g 增加至86.66 μg/g，表明温度提升有利于此3 种香味物质含量的增加。同时，外加脯氨酸能够显著增加此3 种物质的含量，可能是脯氨酸催化所致。而外加丙氨酸时生成的3 -甲基环戊烷-1,2 -二酮含量较低，可能是丙氨酸对该物质的生成有抑制作用。

醛类产物中，糠醛、5 -甲基呋喃醛和5 -羟甲基糠醛含量均随反应温度升高而增加，该类物质多由糖类物质降解反应产生，反应温度升高促进了糖类物质的降解。外加氨基酸会降低这几种物质的生成，如140 ℃反应条件下，引入脯氨酸和丙氨酸后糠醛的含量由62.38 μg/g 分别减少为15.41 和47.07 μg/g，可能与糠醛与氨基酸间的美拉德反应消耗底物有关[24]。

同时，氨基酸引入对苯酚、愈创木酚生成的含量影响较小。对于吡啶和2 -甲基吡嗪等杂环类香味成分而言，由于该类物质的形成主要发生在美拉德反应的最后阶段[25]，由氨基化合物与羰基、醛的中间体反应产生，因此氨基酸引入可明显提高二者含量。此外，液相产物中的烟碱含量随温度升高而增加，也因氨基酸的引入而增加。将所得液相香味产物进行卷烟加香感官评价，结果显示试验组220-P所得水热液相产物加香效果最优，表现为降低卷烟刺激性，增加劲头和香气饱满度。140-A 样品可明显增加焦糖香韵，醇和烟气；220-O 样品主要表现为增加卷烟焦糖烘烤香气特征。

3 结论

通过引入外源氨基酸，研究了氨基酸引入对烟草水热液化产物的影响，采用GC-MS 对产物进行分析，得出以下结论，140 ℃和220 ℃反应温度下，烟草水热液相产物中共检测出包括酮类、醛类、醇类、杂环等在内的81 种挥发性成分，其中主要为美拉德反应产物及烟草自身溶出物，如糠醛、糠醇、5 -甲基呋喃醛和2 -甲基吡嗪等小分子杂环产物。液相产物中挥发性成分及含量随反应温度升高而增加，与高温促进了降解反应及物质溶出有关；脯氨酸与丙氨酸通过参与美拉德反应提高液相产物含量，其中脯氨酸明显提高酮类物质含量，丙氨酸则明显提高杂环类尤其是吡嗪物质的含量。试验组220-P，140-A 和220-O 所得液相产物卷烟加香效果较好，可明显提升卷烟烘烤焦糖香，丰富烟香，进而提升卷烟感官品质。