玉米须总黄酮含量检测络合显色体系的比较

徐晓伟，李柱刚，李晓娟，王珣，赵伟，冷春旭，赵曦，陆杰，韩浩

（1.黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，生命科学学院，黑龙江省寒区植物基因与生物发酵重点实验室，黑龙江哈尔滨 150080）（2.黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，黑龙江哈尔滨 150028）（3.黑龙江省农业科学院生物技术研究所，黑龙江省南瓜育种与深加工工程技术研究中心，黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室，黑龙江哈尔滨 150028）

玉米须，为禾本科一年生草本植物玉蜀黍（Zea mays）的花柱和柱头[1-3]。玉米须是一味常见的中草药，民间常作为药茶和药膳食用，最早记载于明代中医著作《滇南本草》。现代研究发现，玉米须含有多种生物活性成分，如多糖、黄酮、甾醇、有机酸、皂苷[4-7]等。其中黄酮是玉米须中最重要的活性成分之一，有研究表明黄酮类化合物具有抗菌消炎、抗癌、抗氧化、降血糖、降血脂等作用，是临床上治疗心血管疾病的良药，对强心、抗心律失常、降低血清胆固醇均有疗效[8-15]。

黄酮类化合物是玉米须质量评判的指标性成分，因而准确测定玉米须总黄酮（Corn Silk Total Flavonoids，CSTF）含量具有十分重要的意义。目前总黄酮含量测定的方法主要有薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography，TLC）、分光光度法、HPLC法和高效液相色谱-质谱联用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLCMS）等[16-22]。其中TLC 法灵敏度低。HPLC 和HPLC-MS 准确性和灵敏度高，但检测成本高。分光光度法操作简便、耗时短，但很难避免复杂的成分对测定结果的干扰。如玉米须中的绿原酸，在碱性条件下会与铝离子发生络合反应，在常用的显色体系[NaNO2-Al(NO3)3-NaOH]中，可能会干扰CSTF 含量测定结果[21]。因而，有必要对CSTF 含量测定络合显色体系适用性进行研究。目前总黄酮含量检测的络合显色体系主要有三氯化铝比色法（KAc-AlCl3、NaNO2-AlCl3-NaOH）和硝酸铝比色 法[NaNO2-Al(NO3)3-NaOH、KAc-Al(NO3)3][21-23]。HPLC 法可不受绿原酸干扰，但直接检测CSTF 需要较多的对照品和预处理（如分级萃取等）减少杂质后检测。因此，通过HPLC 法筛选适合CSTF 含量测定的络合显色体系，既可排除绿原酸的干扰，又可解决HPLC 法难于直接检测CSTF 含量的问题。迄今未见有关CSTF 含量检测络合显色体系适用性的相关报道。

综上所述，本实验采用溶剂法和分级萃取法依次获得CSTF 提取物和各级萃取物，通过比较提取物与不同对照品在不同显色体系下的光谱数据和标准曲线相关性，排除部分不适合络合显色体系的对照品；以分级萃取物为检测样品，应用HPLC 法筛选适用于CSTF 含量测定的络合显色体系，从而建立一种简易、快速、准确测定CSTF 含量的分光光度法，以期为玉米须黄酮类物质的开发利用和质量管控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米须，本实验采购于哈尔滨市；槲皮素、槲皮苷、木犀草素、木犀草苷、芦丁、芹菜素、表儿茶素纯度均≥98%，成都曼思特生物技术有限公司；无水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、九水硝酸铝、三氯化铝（结晶）均为分析纯，国产；甲醇、乙腈均为色谱纯，天津星马克科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1601 紫外分光光度计，北京伯泰科仪器股份有限公司；KQ-600V 型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE52 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；L-2000 高效液相色谱仪，HITACHI 日立科学仪器有限公司；DHG-9010 烘箱，上海一恒科学仪器有限公司；超纯水仪器，赛多利斯公司。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米须分析样品的制备

1.3.1.1 制备玉米须总黄酮提取液

依据课题组前期优化的样品制备方法，精确称取干燥、粉碎的玉米须（过60 目筛）1.00 g 置于锥形瓶中，加入体积分数为60%乙醇溶液，料液比1:30 g/mL，超声提取1.50 h，过滤并收集滤液。将过滤后剩下的滤渣重复提取二次后，将滤液合并，放置4 ℃冰箱中保存备用。实验另重复5 次，用于1.3.4中CSTF 含量检测。

1.3.1.2 制备EAE和n-BuOH萃取物。

取干燥粉碎后玉米须20.00 g，按1.3.1.1 中方法提取，将滤液合并后置于500 mL 旋蒸瓶中，减压蒸馏至无醇味，将浓缩液倒入分液漏斗中，依次采用正己烷（Normal Hexane，n-Hexane）、乙酸乙酯（Ethyl Acetate Extracts，EAE）和正丁醇（Bormal Butanol，n-BuOH）、等体积萃取2 次后合并相同萃取层，对各萃取液进行减压蒸馏，得到n-Hexane 萃取物（油状）0.36 g、EAE 萃取物0.20 g 和n-BuOH萃取物0.37 g，置于冰箱中4 ℃保存备用。n-Hexane萃取物主要为非极性挥发油类物质，因此本研究重点讨论EAE 和n-BuOH 萃取物。

1.3.2 分光光度法不同络合显色体系的考察

1.3.2.1 不同络合显色体系最大吸收波长的确定

按如下方法制备对照品标准液，精确称取芦丁5.00 mg，加入体积分数为60%乙醇定容至25 mL，得到0.20 mg/mL 芦丁标准溶液。分别精密称取5.00 mg 芹菜素、槲皮素、芒柄花黄素和表儿茶素于10 mL 容量瓶，体积分数为60%乙醇定容，分别得到0.50 mg/mL 芹菜素、槲皮素、芒柄花黄素和表儿茶素标准溶液。各标准液于冰箱中4 ℃保存备用。

NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH 络合显色反应体系参照丁嘉信等[24]的方法进行该体系下络合显色反应。准确移取CSTF 提取液和稀释后各标准液1 mL，依次加入质量分数5% NaNO2溶液0.30 mL，振荡摇匀，静置5 min，加入质量分数10% Al(NO3)3溶液0.30 mL，6 min 后加入1 moL/L NaOH 4.00 mL摇匀，静置反应15 min，以体积分数60%乙醇定容，并作为参比溶液，在300～600 nm 下进行连续波长扫描，绘制CSTF 提取液和各标准液在该显色体系下光谱图，并确定最大吸收波长，将0.30 mL质量分数10%的Al(NO3)3溶液换成质量分数10%的AlCl3溶液重复该实验。

KAc-Al(NO3)3/AlCl3络合显色反应体系参照徐兰英等[23]方法进行该体系下络合显色反应。准确移取CSTF 提取液和稀释后各标准液0.30 mL，依次加入0.10 mol/mL Al(NO3)3溶液2 mL，静置6 min，再加入1 mol/mL KAc 溶液3 mL，静置15 min，以体积分数60%乙醇定容，并作为参比溶液，在250～600 nm 下进行连续波长扫描，绘制CSTF 提取液和各标准液在该显色体系下光谱图，并确定最大吸收波长。将2 mL 0.10 mol/mL 的Al(NO3)3溶液换成0.10 mol/mL 的AlCl3溶液重复该实验。

1.3.2.2 不同络合显色体系标准曲线的绘制

NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH 络合显色反应体系：分别准确移取1.3.2.1 中五种标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 置 于10 mL 容量瓶中定容。按照1.3.2.1 中NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH 络合显色反应体系方法操作步骤制备待检测溶液，以体积分数60%乙醇作为参比溶液，在最大吸收波长下检测吸光度，以质量浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标绘制标准工作曲线。将0.30 mL 质量分数10%的Al(NO3)3溶液换成质量分数10%的AlCl3溶液重复该实验。

KAc-Al(NO3)3/AlCl3络合显色反应体系：分别准确移取1.3.2.1 中五种标准品溶液0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL 置于10 mL 容量瓶中定容。按照1.3.2.1 中KAc-Al(NO3)3/AlCl3络合显色反应体系方法操作步骤制备待检测溶液，以体积分数60%乙醇作为参比溶液，在最大吸收波长下检测吸光度，以质量浓度为（x）轴，吸光度为（y）轴绘制标准工作曲线。将2 mL 0.10 mol/L Al(NO3)3溶液换成0.10 mol/L AlCl3溶液重复该实验。

1.3.2.3 不同络合显色体系EAE和n-BuOH萃取液中总黄酮含量测定

准确称取5.00 mg EAE 和n-BuOH 萃取物，置于10 mL 容量瓶，体积分数为60%乙醇定容，得到EAE 和n-BuOH 待测液，4 ℃保存待用。

NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH 络合显色反应体系：将EAE 和n-BuOH 待测液稀释一定倍数，按照1.3.2.1 中方法反应后在510 nm 下测其吸光度。将吸光值带入NaNO2法的标准工作曲线中计算总黄酮含量。

KAc-Al(NO3)3/AlCl3络合显色反应体系将EAE和n-BuOH 待测液稀释一定倍数，按照1.3.2.1 中方法反应后在418 nm 下测其吸光度。将吸光值带入KAc 法的标准工作曲线中计算总黄酮含量。

1.3.3 HPLC法测定EAE和n-BuOH萃取液中总黄酮含量

1.3.3.1 HPLC色谱条件

参照谢彩侠等[25]方法的色谱条件测定EAE 和n-BuOH 萃取液中总黄酮含量。菲罗门反相C18色谱柱（4.60 mm×250 mm，5 µm）；流动相：甲醇-0.20%体积分数磷酸水溶液，梯度：0～100 min，40%～60%体积分数甲醇，45～85 min，60%～70% 体积分数甲醇，85～100 min，70%～70%体积分数甲醇；流速：0.80 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 µL。

1.3.3.2 HPLC工作曲线的建立

准确称取芦丁、芹菜素、木犀草素、槲皮素、木犀草苷、异红草苷、异鼠李素、表儿茶素和芒柄花黄素5.00 mg，甲醇溶解定容至10 mL，配置成0.50 mg/mL 标准工作液，将各标准品梯度稀释（浓度范围见表3），经HPLC 检测后，以9 种标准品的质量浓度（x）为横坐标-峰面积（y）为纵坐标绘制标准工作曲线。

1.3.3.3 测定EAE和n-BuOH萃取液中玉米须黄酮含量

分别准确移取1 mL 1.3.3.3 中配制的EAE 和n-BuOH 待测液，0.22 µm 滤膜过滤后进样，待测液按1.3.3.1 中色谱条件进行分析，所得峰面积代入1.3.3.2 建立的标准工作曲线计算玉米须黄酮含量。

1.3.4 KAc-Al(NO3)3络合显色法测定CSTF含量的计算

以芦丁为对照品，采用KAc-Al(NO3)3络合显色体系与1.3.1.1 中制备的5 份CSTF 提取液进行络合反应，检测总黄酮含量。

总黄酮含量计算公式如下：

式中：

X——CSTF 含量，%；

A——标准工作曲线计算得到总黄酮的质量浓度，mg/mL；

B——稀释体积倍数，mL；

M——样品的质量，g。

1.4 数据处理

采用Excel 2019 软件对试验1.3.2 和1.3.3 数据进行统计和分析，所有实验数据均重复测定3 次取平均值。

2 结果与讨论

2.1 不同络合显色体系CSTF光谱分析

将CSTF 提取液和各标准品于不同络合显色体系下进行反应，根据不同体系显色区域分别在300～600 nm 和250～600 nm 波长范围进行扫描。图1a和图1b 为NaNO2显色体系下Al(NO3)3和AlCl3的显色结果，如图1a 和图1b 所示，CSTF 和芦丁在波长500 nm 左右均有最大吸收值，槲皮素、芹菜素、表儿茶素和芒柄花黄素在波长450～600 nm 之间均无最大吸收，因此，不同铝盐对NaNO2显色体系的影响不大，由此表1 中仅列出NaNO2显色体系下Al(NO3)3部分的光谱数据。由表1 可知，在NaNO2显色体系下，CSTF 与对照液芹菜素、槲皮素、表儿茶素和芒柄花黄素的最大吸收波长相差较大，分别是122、140、162 和200 nm，与对照液芦丁的最大吸收波长最为接近，仅相差14 nm，因而根据光谱数据排除槲皮素、芹菜素、表儿茶素和芒柄花黄素，芦丁为NaNO2显色体系下最适对照品。

表1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和KAc-AlCl3反应体系的最大吸收波长 (nm)Table 1 The maximum absorption wavelength of NaNO2-Al(NO3)3 -NaOH and KAc-AlCl3 reaction systems (nm)

图1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH（a）、NaNO2-AlCl3-NaOH（b）、KAc-Al（NO3）3（c）和KAc-AlCl3（d）反应体系的紫外-可见光谱图Fig.1 UV-visible spectrogram of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH (a),NaNO2-AlCl3-NaOH (b),KAc-Al(NO3)3 (c),and KAc-AlCl3 (d) reaction systems

图1c 和图1d 为KAc 显色体系下Al(NO3)3和AlCl3的显色结果，如图1c 和图1d 所示，CSTF 和芦丁在波长400 nm 左右均有最大吸收值，槲皮素和芒柄花黄素在波长450 nm 左右均有最大吸收，芹菜素和表儿茶素在波长400～600 nm 之间均无最大吸收，因此，不同铝盐对KAc 显色体系的影响不大，由此表1 中仅列出KAc 显色体系下AlCl3部分的光谱数据。由表1 可知，在KAc 显色体系下，CSTF 与对照液槲皮素、表儿茶素和芒柄花黄素的最大吸收波长相差分别为107、94 和126 nm，因而根据光谱数据可知槲皮素、表儿茶素和芒柄花黄素作为对照品测定CSTF 含量是不适合的。

2.2 不同络合显色体系标准曲线的绘制

表2 为5 种对照品在两种络合显色反应体系下的标准工作曲线数据。由表2 可知，芦丁在两种体系下均呈现良好的线性关系（R2≥0.99）；芹菜素在以Al(NO3)3为铝离子进行络合反应的体系中，线性关系良好（R2≥0.99）；表儿茶素在NaNO2反应体系中，线性关系良好（R2≥0.99）；芒柄花黄素在KAc反应体系中，线性关系良好（R2≥0.99）。将线性关系良好的对照品及相应络合显色体系用于接下来分光光度法测定EAE 和n-BuOH 萃取液中总黄酮含量。

表2 芦丁、芹菜素、槲皮素、表儿茶素和芒柄花黄素对照品在NaNO2和KAc显色体系的标准工作曲线Table 2 Standard working curve of Rutin,Apigenin,Quercetin,Epicatechin and Anthocyanin under different reaction systems

2.3 EAE和n-BuOH萃取液中总黄酮含量的测定

2.3.1 HPLC测定EAE和n-BuOH萃取液中总黄酮含量

2.3.1.1 HPLC工作曲线的建立

将芦丁、表儿茶素、木犀草苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、芒柄花黄素、异红草苷、异鼠李素分别进行2 倍梯度稀释，以标准品的浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准工作曲线，实验数据和浓度范围见表3。结果表明标准工作曲线线性关系良好（R2≥0.99）。

表3 9 种主要玉米须黄酮的HPLC标准曲线数据表Table 3 Linear regression data of nine main flavonoids in corn silk

2.3.1.2 HPLC检测分离9种玉米须黄酮

将EAE 和n-BuOH 待测液通过0.22 µm 滤膜后按照1.3.3.1 的方法进行检测，检测结果如图2 所示。将图谱中待测液与标准品的保留时间比较可知，峰1 为异红草苷，RT：3.64 min，峰2 为木犀草苷，RT：3.92 min，峰3 为表儿茶素，RT：32.52 min，峰4 为芦丁，RT：53.30 min，峰5 为槲皮素，RT：59.19 min，峰6 为木犀草素，RT：66.18 min，峰7为芹菜素，RT：81.78 min，峰8 为异鼠李素，RT：82.36 min，峰9 为芒柄花黄素，RT：85.36 min。九种黄酮的峰型和分离度均良好。EAE 和n-BuOH 待测液检测结果如图2b 和2c 所示，在EAE 萃取物和n-BuOH 萃取物中，含量最高的为异红草苷。将各物质峰面积代入标准曲线计算含量，数据结果如表4 所示，EAE 和n-BuOH 中主要黄酮总含量分别为83.45%和57.36%。

表4 EAE和n-BuOH萃取液中HPLC法测定9种黄酮的含量Table 4 The contents of nine kinds of flavonoids in EAE and n-BuOH extracts determined by HPLC

图2 9 种玉米须黄酮的HPLC 色谱图（a）、EAE 萃取物的HPLC 色谱图（b）和n-BuOH 萃取物HPLC 色谱图（c）Fig.2 Chromatogram of nine main flavonoids in corn silk (a),chromatogram of the ethyl acetate extract (b),chromatogram of the n-BuOH (c)

2.3.2 分光光度法不同络合显色体系测定EAE和n-BuOH萃取液中总黄酮含量

在NaNO2和KAc 络合显色体系下，相应波长范围内，对EAE 和n-BuOH 中总黄酮含量进行检测分析，检测结果如表5 所示。其中，以芦丁为对照品，NaNO2体系下，EAE 总黄酮测定值达到153.74%和138.03%，n-BuOH 总黄酮测定值达到184.03%和160.18%；KAc 体系下，AlCl3法中EAE 和n-BuOH萃取液中总黄酮测定值达到105.84%和112.48%，与实际值偏离较大。有文献报道络合反应发生在黄酮类B 环的邻二酚羟基部位[26]，而玉米须中的非黄酮物质绿原酸同样具有邻二酚羟基结构，与黄酮类物质一样可发生络合显色反应，这可能就是以上反应体系下总黄酮测定值偏大的原因。任顺诚等[27]比较了黄酮类测定方法，同样认为NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 不适合测定玉米须黄酮含量。

表5 分光光度法检测EAE和n-BuOH萃取液中总黄酮含量Table 5 Spectrophotometric determination of Total Flavonoids in EAE and n-BuOH extracts

表6 芦丁为对照品的KAc-Al(NO3)3法测定总黄酮含量Table 6 KAc-Al(NO3)3 method determination of total flavonoids

由表4 可知，HPLC 测定的EAE 和n-BuOH 中黄酮物质总含量分别为83.45%和57.36%。该结果比任顺诚等[27]采用HPLC 法测定结果偏大，这可能是由于分析样品，样品处理方法，液相分析条件，以及外标参考不同导致，任顺诚仅采用槲皮素作外标。在EAE 和n-BuOH 中肯定还存在其他黄酮类物质，因此无论采用NaNO2或KAc 两种络合显色体系测定的黄酮含量都应大于83.45%和57.36%。由表5 可知，与HPLC 法结果较接近的是以芦丁为参照物，KAc-Al(NO3)3体系下测得的总黄酮含量。推测含有邻二酚羟基的非黄酮类物质在KAc-Al(NO3)3显色体系反应中无吸收波长，所以对显色结果无影响。以黄酮类芹菜素、黄烷醇类表儿茶素和异黄酮类芒柄花黄素为参照物的显色体系与HPLC 法检测结果差别较大，推测可能由于它们均为黄酮苷元类物质，而玉米须中n-BuOH 和EAE 提取物主要为黄酮苷类物质，二者结构存在一定差异所导致。因此，选定以芦丁为标准品的KAc-Al(NO3)3法为CSTF 含量测定的最佳方法。

2.4 CSTF含量的测定

以芦丁为标准品，采用KAc-Al(NO3)3法测定CSTF 含量，连续测定5 次，平均值为1.08%，相对标准偏差0.035%。

3 结论

实验建立了一种简单、准确的玉米须中总黄酮类物质含量测定的方法。通过比较以不同类型黄酮为参照物（芦丁、芹菜素、槲皮素、表儿茶素、芒柄花黄素），不同显色体系[NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH 和KAc-Al(NO3)3/AlCl3]中各个样品的总黄酮含量，最终通过HPLC 法筛选得出以芦丁为对照品的KAc-Al(NO3)3法是最适合的显色体系，并考察了该体系下玉米须提取液总黄酮含量。该方法排除了含有邻二酚羟基结构物质的干扰，准确度高，重现性好，操作简便，实验结果为其它植物中黄酮类物质含量的准确测定提供了参考依据。同时，为玉米须中黄酮类化合物的深入研究和在不同研究领域的进一步开发利用提供参考依据。