致大米黄变优势菌株的分离鉴定及其对大米氨基酸含量的影响

陈晓璐, 冯 儒, 王俊仁, 雷 瑶, 仝文君, 张玉申, 都立辉

(南京财经大学食品科学与工程学院1,南京 210000) (江苏省农垦米业集团有限公司2,南京 210000) (江苏省农垦农业发展股份有限公司现代农业研究院3,南京 210000)

小麦、稻谷、玉米被称为世界三大主要粮食作物[1],其中稻谷是我国第一大粮食作物,其产量与播种面积位居世界第一,供应着65%以上人口的口粮[2]。稻谷采收后经过晾晒、砻谷脱壳、碾米得到精制白米,由于大米储藏时间较长,期间大米会发生黄变,黄变会严重影响大米的外观、品质和消费量。不仅如此,食用部分被真菌感染的黄变大米会引起食用者健康问题[3]。因此,人们对于黄变大米的关注度大大提高。

引起大米黄变的原因错综复杂,目前有关黄变大米的研究主要集中在黄变大米与正常大米的理化性质差异和品质变化等方面。对于大米黄变发生的条件因素和机理鲜有报道,其中有关微生物对大米黄变影响的研究更是少之又少。自然环境条件能够诱导大米黄变,其中温度和湿度水平被认为是引起大米黄变的主要原因,并且湿度条件更容易引起大米黄变,此外储藏空间中的O2和CO2浓度和比例也对大米黄变产生影响[4]。微生物的存在对大米黄变有着微妙的作用,真菌感染能够在一定程度上引起水稻黄变[5],Schroeder等[6]的研究中也指出了真菌侵染与大米黄变之间的关系。收获期间部分田间真菌能够使种子变色,籽粒枯萎,导致胚珠死亡,此外田间真菌还会引起加热,使得稻谷品质急剧下降[7]。微生物发育是水稻储藏期间重要的生命活动之一,当堆放的稻谷晾晒不完全时,上层水稻含有较高的水分含量使得微生物活性增强,进而导致水稻干物质的损失同时对水稻黄变产生一定的影响。此外,真菌代谢物能够致使单个水稻籽粒发生黄变,同时非酶褐变也会作用于大米黄变进程[8]。非酶褐变反应包括焦糖化反应、美拉德反应、抗坏血酸氧化分解和多元酚氧化4种类型[9],其中美拉德反应被认为是导致大米黄变的机制之一,反应过程中能够产生5-羟甲基糠醛(5-HMF)等一系列由黄到棕的呈色产物[10],而氨基酸作为美拉德反应的底物之一,其含量与比例对美拉德反应进程有很大的影响。在谷氨酸反应的过程中5-HMF的含量最高,而半胱氨酸和甘氨酸参与的反应中5-HMF含量低[10]。此外L-半胱氨酸的巯基与还原糖的羰基有可能发生亲核加成反应,进而抑制蛋白质或其他氨基酸与糖类发生美拉德反应[11],阻止黄色物质的产生。已有研究表明真菌侵染在一定条件下可能会引起水稻黄变,并且真菌代谢产生的能量也为美拉德反应提供了一定的能量基础,加速大米黄变进程,但真菌侵染与大米黄变间的直接关系鲜见报道。

本研究通过分离自然黄变大米上的菌株,并纯化筛选找到致使大米黄变的优势菌株,模拟真菌侵染大米黄变的过程,对引起大米黄变的优势菌株进行鉴定,通过对比分析不同黄变程度的大米与正常大米之间氨基酸种类的差别,研究各种氨基酸在大米黄变中的变化与作用,为微生物侵染大米黄变机制的研究提供一个新的方向。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

实验原始材料为市售大米;分析纯(AR)试剂:氯化钠、乙酸、盐酸、丙三醇;优级纯(GR)试剂:柠檬酸三钠;纯化及PCR相关试剂、T载体、感受态细胞、引物(ITS1/ITS4);马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose agar,PDA)。

1.2 仪器

L8800全自动氨基酸分析仪,TM3000台式扫描电子显微镜,DYY-10C型电泳仪,CM-5色差仪,BIO-RAD全自动化学发光图像分析系统,ZEISS正置荧光显微镜,HR21M冷冻高速离心机,96孔PCR扩增仪。

2 方法

2.1 优势黄变菌株的分离

用适量无菌水浸泡洗脱大米上存在的菌株,将洗脱液涂步到PDA培养基上,于28 ℃恒温培养箱中培养,培养4 d时分离并纯化培养基上的菌落,将分离纯化后的单菌落制成1×106CFU/mL新鲜孢子悬液,接种于无菌大米上,期间记录真菌侵染大米黄变的情况,挑选出侵染效果佳、稳定性好的优势菌株。保存于质量分数40%的甘油中,-20 ℃保藏。

2.2 形态学观察

将优势黄变菌株接种于PDA培养基上,观察其生长速率与菌落形态,分别于第3、5、7天拍摄其菌落形态,并结合插片法[12]于扫描电子显微镜下观察菌株的菌丝及孢子形态。

2.3 分子生物学方法

2.3.1 ITS基因片段的PCR扩增

ITS区域的扩增选择真核生物通用扩增引物ITS1∶5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[13]。PCR的扩增条件为95 ℃预变性3 min,95 ℃变性30 s,50 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共30个循环,最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增采用的25 μL反应体系,刮取一定量新鲜菌丝体作为模板,加入2×mix 12.5 μL,上下游引物各1 μL,ddH2O 10.5 μL,配制成25 μL的体系,进行PCR扩增。1.5%琼脂糖凝胶在120 V 20 min条件下电泳检测PCR扩增产物,于凝胶成像系统上拍照观察[14]。

2.3.2 PCR扩增片段的纯化与测定

利用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物[15],并与T-Vector连接,然后转化至感受态细胞中,并将其涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基上,培养过夜(16 h);挑取平板上的白色单菌落,将其加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜;取2 μL菌液作为模板进行PCR扩增,PCR反应体系为25 μL,包括8.5 μL的ddH2O,12.5 μL的2×mix,1 μL的上游引物,1 μL的下游引物,引物为ITS通用引物,最后进行电泳检测,寻找目的片段。

2.3.3 DNA序列测序和系统发育学分析

将纯化后的ITS的单克隆PCR产物交由生物公司进行测序。获得目的序列后,在NCBI中进行BLAST序列比对,建立系统发育树,基于其共同的祖先原则,可以直观地表达出物种之间的亲缘关系和进化方向口[16],进而确定菌株的种属类别,最后MEGA 11建树分析。将优势黄变菌株的鉴定序列上传至NCBI数据库中并获得登录号。

2.4 侵染与色度测量

2.4.1 侵染模拟

将分离纯化出的优势黄变菌株置于PDA培养基上培养4～5 d,用无菌水洗脱孢子并计数,将孢子液稀释至1×106CFU/mL备用。在90 mm培养皿中称取11.25 ～11.28 g的无菌大米,并向其中加入约大米质量18%的孢子洗脱液,轻轻震动至孢子液分布均匀。将其置于28 ℃的条件下培养,培养期间观察记录大米黄变情况。

2.4.2 色度测量

将模拟黄变3、7、12 d的样品于通风橱中连续干燥12 h以上,待完全干燥后,用旋风磨粉机19 000r/min磨粉,重复2次,过60目筛,用色差仪检测记录样品的L*、a*、b*值,重复2次,试样粉末保存备用。

2.5 氨基酸种类测定

参考GB 5009.124—2016[17]的方法并稍作修改,准确称取一定量(使试样蛋白含量在10～20 mg)均匀性好的试样,加入6 mol/L的盐酸在恒温干燥箱中110 ℃水解24 h,后将水解液全部转移到50 mL容量瓶并用去离子水定容,取1～2 mL水解液于旋转蒸发仪完全蒸干,蒸干样品用1～2 mL pH 2.2柠檬酸钠缓冲液溶解,过0.22 μm滤膜至进样瓶中待测。

3 结果与分析

3.1 优势黄变菌株分离结果

经过分批侵染实验筛选出6株能够致使大米发生色变的菌株,图1b为优势致黄变菌株,将其命名为B2。相较于其他5株致色变菌株,B2菌株侵染能力强,稳定性好,致黄变周期短且无其他有色成分干扰。此外,图1g中为不能致使大米黄变的对照菌株将其命名为B4。

图1 致大米色变菌株分离结果图

3.2 菌株形态学鉴定

菌株形态学鉴定主要是观察菌落的形态、颜色、生长状态和生长速率,并利用光学显微镜和电子显微镜观察菌丝与孢子形态[18]。将B2、B4菌株于28 ℃培养,观察其3、5、7 d的菌落形态及菌丝与孢子形态。

B2菌株生长能力强,3 d时已形成较大菌落,菌落整体为白色絮状并呈放射状生长。第3～5天,菌落生长速度较快约为3 d时菌落大小的3倍,菌落形态与3 d保持一致。生长至第7天时,菌落铺满整个培养基,整体上看菌落颜色分布均一,呈棉絮状(图2b1～图2b3)。在显微镜下观察,菌丝较光滑,有分支结构,有明显的骨架菌丝和缠绕菌丝,无隔膜。孢子呈圆形,表面不光滑有小刺[19],菌落形态与硬毛粗盖孔菌(Coriolopsistrogii)基本一致(图3b1～图3b2)。

B4菌株3 d时菌落较小,整体上看形成一个橄榄绿色菌落,绒状质地,基本平铺于培养基表面。第3～5天,菌落生长速度加快,呈橄榄绿色,最外圈有少量白色菌丝环绕,此阶段由于孢子产生中央轻微凸起。生长至7 d时,菌落形态与大小与5 d时的菌落整体形态一致,菌落大小在1～2 cm(图2a1～图2a3)。在显微镜下观察菌丝光滑,分生孢子梗直立或弯曲,有节状膨大,具有分生孢子链,孢子呈现梭形、柠檬形、椭圆形,表面较光滑,0～1个隔膜[20],菌落形态与尖孢枝孢菌(Cladosporiumoxysporum)基本一致(图3a1～图3a2)。

图2 B4、B2菌落在PDA平板上生长第3、 5、7天的菌落形态

图3 B4、B2菌丝、孢子形态

3.3 分子生物学分析

B2、B4菌株经过ITS扩增获得全长为646 bp和551 bp的序列(图4)。利用DNAMAN及BLAST对测序结果进行修饰对比。依据真菌分子分类鉴定原则,通过对ITS区域核苷酸序列进行比对,序列相似性大于99%的菌株为同种,序列相似性小于99%大于95%的为相同属,序列相似性小于95%的鉴定为相同科[21]。根据ITS序列构建系统发育树,B2菌与MW335162.1同处同一分支,为同一个种,表现出较近的亲缘关系(图5a)。B4菌株的ITS序列与Cladosporiumsp.的ITS序列同源性最高(图5b)。将B2、B4的序列在NCBI数据库中进行BLAST比对,其中B2菌株的ITS序列与Coriolopsistrogii的同源性最高,为100%。综合菌落、孢子、菌丝形态可知,B2菌隶属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲 (Agaricomycetes) 多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)革孔菌属(Coriolopsis)[22],也被命名为Trametestrogii[23]、Funaliatrogii[24]。B4菌株与Cladosporiumoxysporum的同源性最高,为99.69%。综合菌落、菌丝、孢子形态可知,B4菌属于半知菌亚门(Deuteromycota)丝孢纲(Hyphomycetes)丛梗孢目(Miniliales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢属(Cladosporium)尖孢枝孢菌(Cladosporiumoxysporum)[25]。将B2菌株的序列上传至NCBI的数据库中,获得NCBI登录号为PRJNA896760。

图4 B2、B4菌株的ITS基因片段扩增图

3.4 侵染结果与色度分析

3.4.1 侵染结果

图6分别为无菌水处理的对照组、B4、B2菌株侵染的试样组生米黄变结果图,结合图7中蒸后大米的黄变结果图,可以看出不同菌株的侵染效果之间存在明显差异。对照组试样在储藏期间未发生明显的颜色变化,相较之下,B2菌株表现出极强的侵染黄变作用,并且随着储藏时间的延长B2菌株侵染后黄变大米的比例和程度也达到更高水平。首先B2菌株的菌落为纯白色,实验期间基本不会影响对大米色变的观察。其次储存1 d时,大米表层基本无菌体覆盖,大米颜色未发生显著变化。B2菌生长能力强,生长速度快,3 d时大米表层均匀覆盖一层白色菌体,整体上看各部分米粒颜色均匀一致,蒸熟后部分米粒发生黄变。3～5 d B2菌快速生长,大米粒表层被白色菌体紧紧覆盖,相较于第3天的生长状态,米粒表面的菌体更密集更厚实,对比蒸熟大米发现绝大部分米粒发生黄变。5～7 d大米颜色基本无变化,蒸前和蒸后差异很小,整体稳定。12 d时,蒸前大米表面菌体厚实均一,米粒呈现黄棕色,对比7 d的试样12 d大米的黄变现象更明显。B4菌株在储藏过程中未能使大米发生黄变,但由于其菌落为橄榄绿色会在储藏过程中降低大米亮度。

图5 基于ITS序列构建B2(a)、B4(b)菌株的系统发育树

注:a、b、c分别为对照组、B4、B2菌株侵染大米第1、3、5、7、12天生米结果图图6 生米结果图

注:a、b、c分别为对照组、B4、B2菌株侵染大米第1、3、5、7、12天生米结果图图7 熟米结果图

3.4.2 黄变米的色度分析

表1中记录了各条件下大米的L*、a*、b*值,其中NR为未经任何处理的普通白米。L*值代表了样品的明暗程度,数值在0～100之间,L*越大说明样品亮度越高。显然试样的亮度均处于较高水平,相较于正常大米,各处理条件下的大米其亮度值均降低,但无菌水处理的对照组大米亮度值并无显著性差异。a*值的大小代表了样品的红绿程度,数值在-80～100之间,a*>0表示偏红,a*<0表示偏绿。所有试样的a*均大于零,整体偏红,并且导致黄变的菌株,其对大米a*值的影响是随着黄变程度的加深而升高的,表现出更高的a*值,整体更红。b*值代表了样品黄蓝程度的变化,数值在-80～70之间,b*>0表示偏黄,b*<0表示偏蓝。显然所有试样都是b*>0,整体偏黄,对照组组内试样在培养期间b*值未发生明显变化,而B2菌株侵染黄变的试样b*值随培养时间的延长而增大,与NR和CK组数值存在显著差异,黄色明显。

表1 NR、CK、B4、B2试样不同天数时色度对比(NR为普通白米)

3.5 氨基酸含量变化

由优势黄变菌株B2侵染的黄变大米试样中丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸占总氨基酸的比例整体上呈下降趋势(图8c),而CK组和B4菌株侵染的试样组中,这几类氨基酸所占比例未发生明显降低,甚至B4组中丙氨酸、缬氨酸、精氨酸所占比例有所上升(图8a、图8b)。由B2菌株侵染的黄变试样中,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸随着储藏时间延长、黄变程度加深,其占比持续降低,并且与对照组(NR)试样存在显著性差异,有可能参与到大米黄变过程,作为美拉德反应的底物参与合成进而产生呈色物质[26],导致大米黄变。美拉德反应的本质就是氨基酸、蛋白质与还原糖之间复杂的反应[27],并且美拉德反应过程中会产生5-HMF、类黑精等一系列由黄到棕的呈色产物,其中5-HMF是最主要的呈色物质之一,其生成量受到氨基酸种类的影响,在谷氨酸反应的过程中5-HMF的含量最高,而半胱氨酸和甘氨酸参与的反应中5-HMF含量低[10]。Troise等[28]的研究中发现Arg的胍基和Lys的ε-氨基侧链能与附着在蛋白质亲和侧链上的羰基结合发生美拉德反应。在任芳等[29]的研究中指出,优质稻谷在黄变过程中随着黄变程度的加深,谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸含量随黄度指数的增大一直呈现下降的趋势,可能是大米黄变过程中起主要作用的氨基酸。Liu等[30]运用非靶向GC-TOF-MS的方法对黄变大米与正常大米的差异产物进行分析,指出氨基酸是大米黄变过程中变化最显著的代谢物,碳水化合物、有机酸、脂肪酸和脂质紧随其后。Liu等[30]还通过靶向LC-ESI-MS/MS的方法对黄变大米与正常大米进行差异分析,发现黄酮类化合物的代谢增强[31]。黄酮类等抗氧化代谢物的合成与苯丙素代谢途径密切相关[32],而苯丙氨酸和酪氨酸是参与苯丙素代谢途径的主要氨基酸,因此在大米黄变的进程中苯丙氨酸和酪氨酸含量会发生变化。

注:小写字母不同代表数值之间差异显著(P<0.05)。图8 试样在储藏周期内部分氨基酸占总氨基酸的质量分数

4 结论

大米黄变是错综复杂的综合反应,研究证明大米黄变过程中微生物的存在能够对大米黄变产生一定影响,其中硬毛粗盖孔菌(Coriolopsistrogii)是能够稳定且有效引起大米黄变的菌株之一。

通过分析黄变大米与未黄变大米中各类氨基酸含量的变化发现,黄变大米中丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸占总氨基酸的比例随着黄变程度加深而逐渐降低,暗示这些氨基酸可能参与了大米的黄变过程。氨基酸作为美拉德反应的底物之一,能够通过羰氨缩合产生有色物质,而美拉德反应中的5-HMF等呈色产物可能是导致大米黄变的成分。鉴于目前鲜见这方面的研究,分离鉴定美拉德反应中能引起大米黄变的呈色物质将是后续的研究方向。