白酒典型酯类物质在形成空杯香后的释放过程分析

赵腾飞，张 璋，宋露露，胡智慧，唐佳代，龙亚飞

（茅台学院 酿酒工程系，贵州 遵义 564507）

酱香型白酒是中国白酒的典型代表，因其独特的生产工艺和复杂的发酵过程，使其具有“酱香突出，酒体醇厚、细腻优雅，空杯留香持久”的风格特点[1-4]，其中，空杯留香是酱香型白酒的一种重要风味特征。空杯留香是指装盛过优质白酒的酒杯，酒的香气会在杯中保留一段时间的现象[5-7]。GB/T 26760—2011《酱香型白酒》将空杯留香是否持久作为评判酱香型白酒品质的标准之一[5]。然而，目前对白酒空杯香的认知主要集中于感官品评描述阶段，对空杯香香气成分的研究较少[6-8]。

孙文佳等[6]应用静态顶空结合气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪分析酱香型白酒空杯香气成分，结果鉴定出34种空杯留香化合物，其中3-甲基丁醛、乙酸、3-甲基丁酸乙酯等11个化合物香气活度值（odor activity value，OAV）＞1；DAN Q等[7]建立了真空辅助吸附笔提取（vacuum assisted sorbent extraction）结合GC-MS的方法分析8种酱香型白酒的空杯香，结果鉴定出27种共有的化合物，其中乳酸含量最高，且L-乳酸、D-乳酸、十六酸乙酯等7个化合物可作为区分不同酱香型白酒空杯香的标志物。这些研究都增加了人们对空杯香气成分的认知，但是白酒中哪些风味物质更容易在空杯中驻留，以及它们的驻留时间存在哪些差异等有关空杯香形成机制的问题尚不清晰，仍需进一步研究。

顶空固相微萃取技术（headspace-solid-phase microextraction，HS-SPME）是目前应用非常广泛的萃取香气物质的方法[9-12]，该技术结合GC-MS等分析仪器可以检测多种食品中的香气成分[13-16]。因此，本研究拟建立一种以标准白酒品酒杯作为顶空瓶，结合SPME和GC-MS分析空杯香气组分的方法。在验证该方法的气密性、准确性和精密度后，再以白酒中常见酯类物质标准品的乙醇水溶液为研究对象，模拟空杯香的形成过程，并应用该方法分析酯类物质在空杯中的释放过程，以探索空杯香的形成机制，为深入理解白酒空杯香的成因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酯类物质（表1）（纯度均＞97%）、乙醇（色谱级）：上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。标准白酒品酒杯：宿迁市海全科技有限公司；硅胶塞（Φ38 mm）、橡胶塞（Φ38 mm）：镇江杰岛仪器科技有限公司；封口膜（parafilm M）：德国Sigma-Aldrich公司；铝箔纸胶带（0.06 mm厚×50 mm宽）：济宁迅大管道防腐材料有限公司。

表1 本研究所用酯类物质及其相应沸点Table 1 Esters used in this study and their boiling point

1.2 仪器与设备

7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；固相微萃取（SPME）手柄、DVB/CAR/PDMS三相SPME萃取头：美国Supelco公司；LC-MSA-D磁力搅拌器：上海力辰仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酯类混合酒样的制备

参考孙文佳等[6-7]有关白酒空杯香物质的研究以及酯类物质相关研究[17-19]选出24种白酒典型酯类物质，将24种酯类物质溶解至体积分数为50%的乙醇水溶液中制备成酯类混标酒样，所有混标酒样中，酯类物质的质量浓度均为10 mg/L，配制完成后置于-20 ℃冰箱备用。

1.3.2 酒杯顶空瓶结合HS-SPME/GC-MS分析空杯香方法的建立

以标准白酒品酒杯制作顶空瓶[20]，选择适合标准白酒品酒杯尺寸的塞子（橡胶塞或硅胶塞）或封口膜进行密封。封口后，用铝箔胶带纸将瓶口密封（为了保证萃取过程能够正常传质，密封至酒杯的1/3处），再进行HS-SPME萃取，萃取完成后，迅速将萃取针插入温度为250 ℃的GC-MS进样口解吸附5 min，最后进行GC-MS分析。

为了验证该方法的可行性，以空酒杯作为顶空瓶，结合HS-SPME/GC-MS完成以下实验。

密封方式的确定：空酒杯中不添加酒样，直接用硅胶塞和封口膜密封，然后进行HS-SPME/GC-MS分析；同时，与空白萃取针直接进样进行HS-SPME/GC-MS分析对比，考察两种密封方式制作的顶空瓶在HS-SPME过程中是否会引入杂质。每个样品测试3次取平均值。

气密性分析：空酒杯中添加酯类混标酒样1 mL，加超纯水定容至5 mL，加NaCl至饱和后分别用硅胶塞和封口膜密封，密封完成后，分别停留1 h、3 h、6 h、12 h，再进行HS-SPME/GC-MS分析。每个样品测试3次取平均值。

加标回收率和精密度分析：加标前，空酒杯中添加混标酒样1 mL，加超纯水定容至5 mL，加NaCl至饱和后使用硅胶塞密封，进行HS-SPME/GC-MS分析。加标后，空酒杯中添加混标酒样1 mL，加超纯水定容至5 mL，加NaCl至饱和后使用硅胶塞密封，使用GC进样针分别加入质量浓度为200 mg/L丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、十五酸乙酯7种化合物（代表低、中、高沸点的酯类物质）10 μL，进行HS-SPME/GC-MS分析，并计算加标回收率。加标回收率=（加标后质量浓度-加标前质量浓度）/加标前质量浓度×100%。加标后样品测试6次，以6次测试结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表征测试精密度。

1.3.3 应用酒杯顶空瓶结合HS-SPME/GC-MS分析酯类混标酒样形成的空杯香

取15 mL酯类混标酒样加入标准白酒品酒杯中，不封口，轻摇酒杯让酒体在杯壁上均匀旋转，保持15 s，该过程中确保酒体不能外溅；然后在室温静置2 min后，将酒体倒出酒杯，并倒挂酒杯让杯中残留酒样自然滴落，保持1 min后，反转酒杯，停留10 s（为了分析空杯中驻留酯类物质的释放过程，后续实验在保持室温的条件下分别停留5 min、10 min、15 min、30 min、60 min），使残留酒样自然滑落至杯中，之后使用硅胶塞塞住酒杯，并使用铝箔纸胶带封口，封口完成后平衡5 min，再应用HS-SPME/GC-MS分析空杯中的挥发性组分。每个时间点测试3次取平均值。以每个时间段测得的色谱峰面积（酯类物质的空杯顶空浓度）表征酯类物质在空杯中的驻留量。同时，计算各时间段的色谱峰面积与初始（10 s）色谱峰面积的比值以方便分析驻留量的变化趋势。

1.3.4 HS-SPME/GC-MS测试条件[21]

HS-SPME条件：50 ℃预热5 min后，萃取吸附50 min，萃取完成后，迅速将萃取针插入温度为250 ℃的GC-MS进样口解吸附5 min，最后进行GC-MS分析。在每次完成进样分析后，需要对萃取头清理10 min以避免风味物质在萃取头上残留。

气相色谱条件：VF-WAX色谱柱（60m×250μm×0.5μm），进样口温度250 ℃，不分流进样，载气为高纯度氦气（He），流速1 mL/min，升温程序为初始温度50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min速率升温到180 ℃，然后以10 ℃/min升到240 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子电离源（electronic ionization，EI），离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电离能量70 eV，扫描范围40～400 m/z，溶剂延迟时间5 min。

定性定量分析：根据保留时间进行定性，以各酯类物质色谱峰面积表征其相对含量。

1.3.5 数据分析

使用EPIWEB4.1软件计算酯类物质的沸点（boiling point，BP），使用Microsoft Office Excel 2010对数据进行单因素显著性差异分析（P＜0.05）；使用Origin 9.0作图，并结合Adobe Illustrator CS4对图进行文字添加与修饰。

2 结果与分析

2.1 酒杯顶空密封方式的确定

为了制作酒杯顶空瓶，需要使酒杯的密封满足以下条件：密封材料材质柔软，萃取针可以穿过塞子进行萃取；密封材料本身不引入杂质影响空杯组成；密封效果良好，萃取过程中风味物质不泄露。为了确定标准白酒品酒杯顶空的密封方式，本研究选择橡胶塞、硅胶塞和封口膜密封酒杯，但发现橡胶塞材质比较硬，萃取针难以穿过橡胶塞，所以后续实验主要考察硅胶塞和封口膜两种密封方式，具体密封方式见图1。

图1 标准白酒品酒杯的密封及固相微萃取方式Fig.1 Sealing and solid phase microextraction type of standard tasting Baijiu cup

为了考察两种密封方式制作的顶空瓶在HS-SPME过程中是否会引入杂质，采用HS-SPME/GC-MS比较萃取两种密封方式空白酒品酒杯进样和空白萃取针直接进样3种条件下的色谱分析结果，结果见图2。由图2可知，3种分析条件所得色谱结果基本一致，并无信噪比＞3的色谱峰，说明硅胶塞和封口膜两种密封方式均不会引入杂质干扰空杯香成分分析。

图2 硅胶塞和封口膜密封空标准白酒品酒杯制作顶空瓶与空白萃取针的HS-SPME/GC-MS分析色谱图Fig.2 HS-SPME/GC-MS chromatogram of blank headspace bottle made by standard tasting Baijiu cups sealed with silicone plug and parafilm and blank extraction needle

由于实验要应用HS-SPME萃取空杯中的挥发性组分，而该萃取过程需要在50 ℃萃取50 min，长时间高温萃取可能会影响酒杯顶空瓶的气密性。因此，进一步考察以硅胶塞和封口膜密封标准白酒品酒杯进行HS-SPME实验的气密性效果，结果见图3。由图3可知，两种密封方式在密封1 h和3 h，50 ℃萃取50 min后，所得的色谱峰总面积无显著性差异（P＜0.05）；在密封6 h后，硅胶塞密封的色谱峰总面积较3 h有下降趋势，但下降不显著（P＞0.05），而封口膜密封的色谱峰总面积较3 h显著下降（P＜0.05）；在密封12 h后，两种密封方式的色谱峰总面积较3 h均有显著性降低（P＜0.05）。结果表明，3 h内，硅胶塞与封口膜的密封效果无明显差异，均有较好的气密性，但超过3 h后，硅胶塞密封效果强于封口膜。综上，选择硅胶塞密封标准白酒品酒杯制作酒杯顶空瓶。

图3 硅胶塞和封口膜密封标准白酒品酒杯作为顶空瓶的气密性比较Fig.3 Comparison of airtightness between headspace bottles made with standard tasting Baijiu cups sealed with silicone plug and parafilm

2.2 酒杯顶空瓶结合HS-SPME/GC-MS分析方法的验证

为了验证以硅胶塞密封标准白酒品酒杯作为顶空瓶结合HS-SPME/GC-MS分析方法的准确性（回收率）和精密度（相对标准偏差），从24种酯类物质中挑选出7种沸点差异较大和具有特征官能团的化合物进行加标回收率和相对标准偏差分析，结果见表2。由表2可知，7种具有代表性的酯类物质的回收率在96.5%～103.5%之间，精密度试验结果的相对标准偏差在4.2%～6.3%之间，表明这种酒杯顶空瓶结合HS-SPME/GC-MS分析方法的准确性较好，稳定性和精密度较高，可以用来进行空杯香的分析。

表2 硅胶塞密封标准白酒品酒杯作为顶空瓶结合HS-SPME/GC-MS分析方法的回收率和精密度试验结果Table 2 Recovery and precision test results of the method of headspace bottles made with standard tasting Baijiu cups sealed with silicone plug combined with HS-SPME/GC-MS

2.3 酯类物质形成空杯香后的释放过程分析

24种酯类物质在形成空杯香后，随着释放时间的延长，不同沸点酯类物质的释放过程存在较大差异，可将它们分三类进行讨论，24种酯类物质形成空杯香后的释放过程见图4。

图4 酯类物质形成空杯香后的释放过程Fig.4 Release process of esters after forming empty cup aroma

第一类物质是乙酸乙酯、异丁酸乙酯、己酸乙酯等11种沸点（BP=77～167 ℃）相对较低的酯类物质。由图4①～1○可知，随着释放时间的延长，它们的空杯驻留量呈显著下降趋势（P＜0.05），在释放时间为15 min时，驻留量降至初始（10 s）驻留量的1%～5%；在释放时间为30～60 min时，未在空杯中检测出，说明这些酯类物质在30 min时已基本挥发完。由于这类酯类物质沸点较低，在形成空杯香后，较快的挥发速度使它们的空杯驻留量显著下降。同时，由于本实验将酯类物质溶解至体积分数为50%的乙醇水溶液中，在酯类物质的释放过程中，乙醇可能会通过马兰戈尼效应（Marangoni effect）促进酯类物质在空杯中的释放[22]。根据马兰戈尼效应，在酒体与空杯顶空界面，乙醇的挥发会导致酒体表面张力的提高，为了维持体系平衡，酒体中的乙醇分子会移动至酒体与顶空界面来降低表面张力，而在乙醇移动的过程中，一些酯类物质也会随乙醇移动至该界面，因此加速了它们的释放。

第二类是乙酸己酯、己酸丙酯、癸酸乙酯等7种沸点（BP=171～241 ℃）相对较高的酯类物质。由图412○～18○可知，除丁酸己酯和癸酸乙酯外，其他5种酯类物质的空杯驻留量呈现先轻微上升再显著下降的趋势（P＜0.05）。在释放时间为30 min时，7种酯类物质的空杯驻留量基本降至零。

第三类物质是丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯和十四酸乙酯等6个沸点（BP=227～324 ℃）相对较高且结构差异较大的化合物。由图419○～24○可知，长链酯类物质十四酸乙酯（BP=295 ℃）、十五酸乙酯（BP=324 ℃）的空杯驻留量在10 s～15 min之间呈逐步上升的趋势，15 min之后呈显著下降趋势（P＜0.05）；含芳香环酯类物质苯乙酸乙酯（BP=227 ℃）、乙酸苯乙酯（BP=234 ℃）、苯丙酸乙酯（BP=247 ℃）的驻留量在10 s～5 min之间呈现上升趋势，5～10 min呈缓慢下降趋势，10 min之后呈显著下降趋势（P＜0.05）；丁二酸二乙酯（BP=217 ℃）的驻留量在10 s～10 min之间呈显著上升趋势（P＜0.05），10 min之后呈显著下降趋势（P＜0.05）。

推测造成空杯中酯类物质的空杯驻留量呈先上升后下降的趋势与酯类物质和乙醇水溶液的沸点存在较大差异密切相关。当24种酯类物质形成空杯香后，随着释放时间的延长，驻留在空杯中的酯类物质和溶剂乙醇水溶液均有不同程度的挥发，因此会导致驻留于空杯中酒样体积的减少。但由于这24种酯类物质的沸点存在差异，对于沸点相对较高的物质，它们的挥发速度较慢，更易在杯中驻留，因此低沸点酯类和乙醇水溶液的挥发所引起的酒样体积减少能够导致高沸点酯类物质浓度的短暂提高，但这些高沸点酯类物质的空杯驻留量最终会随着释放时间的延长而下降。

同时，研究发现24种酯类物质在空杯中的驻留时间和驻留量也存在较大差异。低沸点酯类物质在形成空杯香的15 min内，空杯驻留量已接近于零。而6个沸点较高的酯类物质在释放时间为60 min时，仍可以在空杯中被检测到，说明高沸点酯类物质的空杯驻留时间相对较长。此外，由图419○～24○可知，与初始释放时间10 s相比，释放时间为60 min时，丁二酸二乙酯的驻留量仍是初始空杯驻留量的140%；而苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯和苯丙酸乙酯的驻留量分别仅占其初始量的2%、4%和6%；十四酸乙酯和十五酸乙酯的驻留量占其初始量的32%、62%，由此也说明酯类物质在空杯中的驻留时间和驻留量不仅与沸点相关，还与它们的自身结构具有一定相关性，但具体关系还需进一步研究。

在不同香型白酒中，酱香型白酒中风味物质的种类相对较为复杂，高沸点物质也较多[23-26]，根据本实验结果可知这些高沸点物质更易在空杯中驻留，且在形成空杯香后也会发生浓度短暂提升的现象，从而形成酱香型白酒“空杯留香持久”的现象。

3 结论

本研究通过气密性研究确定以硅胶塞密封标准白酒品酒杯作为顶空瓶最好，在此基础上，结合顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用仪技术，建立了一种适合分析白酒空杯香的测试方法。该方法对7种酯类物质的加标回收率为96.5%～103.5%，精密度试验结果的相对标准偏差为4.2%～6.3%，具有较好精密度，适合进行白酒空杯香的分析。以溶解于体积分数50%的乙醇水溶液中的24种白酒典型酯类物质为研究对象，应用该方法分析这些酯类物质在形成空杯香后的释放过程发现，随着释放时间的延长，乙酸乙酯、异丁酸乙酯等沸点相对较低的酯类物质在白酒杯中的驻留量呈显著下降趋势；庚酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯等沸点相对较高的酯类物质在空杯中的驻留量呈先上升后下降的趋势。推测该现象由酯类物质之间以及乙醇水溶液的挥发性差异所造成。此外，在24种酯类中，丁二酸二乙酯在酒杯中驻留时间最长，在释放时间为60 min时，其驻留量仍为初始量（10 s）的140%。本实验根据风味物质的释放过程解释了酒体中高沸点物质较多是酱香型白酒空杯留香持久的原因之一，后续将从化合物结构方面分析它们与空杯驻留量和驻留时间的相关性，进一步探讨空杯留香的形成机制。