甲酰基肽受体1 对脊髓损伤后小胶质细胞诱导的炎性反应的影响

宋 扬，钱 澍，魏飞龙，周程沛，袁一方，郭时空，高浩然，钱济先，高全有

空军军医大学第二附属医院骨科，西安 710038

脊髓损伤（SCI）是外力直接或间接作用于脊髓造成的损伤，致残率极高，给患者及其家庭带来沉重的负担［1］。SCI 主要包括原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤往往不可逆转，继发性损伤包括神经胶质细胞活化、炎性反应、外周免疫细胞浸润、出血、缺氧和轴突脱髓鞘等，其中，炎性反应被认为是SCI 患者预后较差的重要因素，抑制炎性反应能够显著降低患者的致死率和致残率［2-3］。小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫细胞，其活化在SCI 相关的神经病理过程中发挥着关键作用［4-5］。病原相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）能够与模式识别受体（PRR）结合，从而发挥免疫调控作用［6］。在中枢神经系统，PRR 主要表达于小胶质细胞、星形胶质细胞和巨噬细胞［7］。近几年，甲酰基肽受体1（Fpr1）作为被关注较多的PRR，被发现在人体固有免疫反应中扮演着重要角色，其病理机制已在多种中枢神经系统疾病模型中得到进一步研究，如脑出血［8］、脑缺血［9］、创伤性脑损伤［10］等。然而，Fpr1在SCI中的作用尚不明确。因此，本研究以Fpr1 为切入点，探究Fpr1 在SCI 发生、发展过程中的可能机制，旨在为SCI 临床治疗和功能康复提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6 ～ 8 周C57BL/6 雄性小鼠由空军军医大学实验动物中心提供，小鼠在空军军医大学唐都医院骨科实验室饲养1 周后进行后续实验，饲养条件：温度22 ～ 25℃、空气湿度50%、正常昼夜交替（12 h 光照/12 h 黑暗），并给予充足的水和食物。所有实验均严格按照动物伦理相关要求进行，本研究动物实验得到空军军医大学伦理委员委员会批准（动物伦理审批号：IACUC-20201003）。

1.2 造模与分组

将30只小鼠随机分为5组，假手术组（sham组）和SCI 造模后1、3、5、7 d 组，每组6 只。SCI 造模采用文献［11］的方法：①采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，俯卧位置于解剖板上；②定位T9脊髓对应锥体，切开皮肤，暴露脊柱，切除椎板，充分暴露脊髓；③利用血管夹钳夹脊髓1 min 形成脊髓挤压伤，对动物进行钳夹的部位为半脊髓，每只动物钳夹的时间与部位均一致，钳夹完成后可见损伤部位充血，小鼠身体出现痉挛，双下肢回缩；④缝合伤口，使用碘伏消毒，术后观察切口愈合情况。Sham组仅手术暴露脊髓，不钳夹脊髓，缝合切口，使用碘伏消毒，术后观察切口愈合情况。在相应时间点对各组小鼠实施安乐死，取脊髓组织等进行后续蛋白质印迹检测和免疫荧光实验。

第一步实验后选择Fpr1 蛋白表达水平最高时间点制作小鼠模型进一步实验，将小鼠随机分为SCI 组和Fpr1 抑制剂（HCH6-1）干预组（HCH6-1 干预组），每组6 只，并与sham 组比较。SCI 组的小鼠按照上述方法施行手术。HCH6-1 干预组小鼠术后即刻接受腹腔注射HCH6-1（50 mg/kg），之后隔日进行腹腔注射1 次［8，12］。Fpr1 蛋白表达水平最高时间点对各组小鼠实施安乐死，取脊髓组织等进行后续蛋白质印迹检测和免疫荧光实验。应用免疫荧光实验评估各组小胶质细胞的活化程度，通过蛋白质印迹检测各组炎性因子［白细胞介素（IL）-1β、IL-18 和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）］以及炎性小体（NLRP3、ASC 和Caspase-1）蛋白的表达情况。

1.3 蛋白质印迹检测

小鼠处死后，取正常脊髓组织和损伤周围脊髓组织进行蛋白提取及定量，蛋白定量采取BCA 蛋白定量测定法，实验方法参考文献［13］。取15 μg蛋白进行SDS-PAGE，然后转膜、封闭、孵育一抗：anti-Fpr1（1∶1 000，Abclonal，中国），anti-IL-1β（1∶1 000，Proteintech，美国），anti-IL-18（1∶1 000，Proteintech，美国），anti-TNF-α（1∶1 000，Proteintech，美国），anti-NLRP3（1∶1 000，Proteintech，美国），anti-ASC（1∶1 000，Proteintech，美国），anti-Caspase-1（1∶1 000，Proteintech，美国）和anti-β-actin（1∶3 000，Abclonal，中国）。4℃过夜后，室温孵育相应二抗。最后使用化学发光试剂盒和成像系统检测蛋白条带。

1.4 免疫荧光实验

免疫荧光实验步骤参考文献［14］。小鼠麻醉后，依次使用PBS 和4%多聚甲醛灌注，然后将脊髓组织依次进行10%、20%、30%蔗糖梯度脱水。根据冰冻切片常规流程进行切片，使用0.5% Triton 打孔15 min 后封闭0.5 h，然后将切片同时孵育一抗anti-Fpr1（1∶200，Abclonal，中国）和anti-Iba1（1∶200，Invitrogen，美国），4℃孵育过夜。使用PBS 对切片进行漂洗，然后加入荧光二抗避光孵育，PBS漂洗干净后，使用封片剂封片，最后使用激光共聚焦显微镜进行拍摄观察。

1.5 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，2 组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。柱状图采用GraphPad Prism 8.3.0 软件绘制。

2 结 果

2.1 Fpr1蛋白表达情况

与sham 组相比，Fpr1 在SCI 后第1 天开始表达增多，第3 天最高，第5 天下降，第7 天下降至与sham 组水平相当（图1）。结果提示，Fpr1 在SCI急性期表达显著增加，可能发挥重要的损伤作用。Fpr1 表达水平在SCI 后第3 天最高，后续实验采取SCI 后第3 天作为研究时间点制作模型。

图1 Fpr1蛋白表达水平Fig. 1 Expression level of Fpr1 protein

2.2 Fpr1的细胞定位

Sham组小胶质细胞呈高度分支化，细胞间的分支基本不重叠，是未激活的状态；SCI 后第3 天，小胶质细胞发生明显活化，表现为突起回缩，胞体增大，呈巨噬细胞样，数量增多，进一步证实Fpr1 在SCI 后表达显著增加。免疫荧光染色结果示Fpr1 主要表达在小胶质细胞（图2）。以上结果提示Fpr1 可能参与小胶质细胞的活化过程。

图2 Fpr1的细胞定位（×50）Fig. 2 Cell localization of Fpr1（×50）

2.3 Fpr1对小胶质细胞的影响

免疫荧光染色结果显示，与sham 组相比，SCI组小胶质细胞发生明显活化，HCH6-1 干预能显著减轻SCI 后小胶质细胞的活化，表现为胞体减小，数量减少（图3）。

图3 小胶质细胞活化情况（×50）Fig. 3 Microglia activation（×50）

2.4 抑制Fpr1对SCI后炎性因子和炎性小体的影响

蛋白质印迹检测结果表明，与sham 组相比，SCI 组小鼠损伤部位周围脊髓组织的炎性因子（IL-1β、IL-18 和TNF-α）和炎性小体（NLRP3、ASC 和Caspase-1）的蛋白表达显著增加；与SCI 组相比，HCH6-1 干预组小鼠损伤部位周围脊髓组织的炎性因子（IL-1β、IL-18 和TNF-α）和炎性小体（NLRP3、ASC 和Caspase-1）的蛋白表达显著减少（图4、5）。

图4 脊髓组织中炎性因子蛋白水平Fig. 4 Protein levels of inflammatory factors

图5 脊髓组织中炎性小体蛋白水平Fig. 5 Protein levels of inflammasomes

3 讨 论

目前，SCI 的发生率逐年递增，其致残致死率高、预后差、治疗及康复费用昂贵［1］。其中，SCI 后继发性损伤（出血、水肿、炎性反应、脱髓鞘等）是导致患者致死致残的重要原因［2］。小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫细胞，占中枢所有细胞的5% ～ 10%，是中枢神经系统第一道免疫防线［15］。SCI 后小胶质细胞形态发生改变并向损伤灶迁移，可以发挥吞噬功能清除细胞碎片，促进神经元和突触的可塑性，但过度激活的小胶质细胞呈阿米巴样（球形）状态，诱导炎性级联反应，对机体产生炎性损伤作用［4］。因此，抑制小胶质细胞的过度活化对于预防SCI 后的神经炎性反应至关重要。既往研究发现，PRR 参与小胶质细胞在SCI 后的炎性和免疫反应。Bell 等［16］的研究显示，toll 样受体4（TLR4）在SCI 后表达升高，抑制TLR4 能够显著抑制小胶质细胞的激活并减轻炎性反应。Hao 等［17］在缺血性脑损伤后，通过使用TLR4 拮抗剂Stepharine，证实了抑制TLR4 能够抑制小胶质细胞的激活。髓系细胞触发受体1（TREM-1）是TREM家族的一员，与多种中枢神经系统疾病相关，如脑出血［18］、脑缺血［19］、阿尔兹海默病［20］等。在SCI 中，抑制TREM-1 能够显著减轻机体氧化应激和小胶质细胞的激活［21］。上述研究均表明，PRR 在小胶质细胞的活化中起着关键作用，因此，明确PRR 在SCI 中的作用对于减轻继发性损伤具有重要意义。

Fpr1 是G 蛋白偶联的趋化受体，也是PRR 的一种，最初在吞噬相关白细胞（如中性粒细胞、单核细胞）中被发现，主要介导细胞趋化和激活，Fpr1的激活能够启动PI3K、PKC、MAPKs、NF-κB等信号通路，参与宿主对微生物的防御过程［22］。Li等［8］的研究表明，在脑出血疾病模型中，循环线粒体N-甲酰基肽是Fpr1 的内源性配体，甲酰基肽与Fpr1 的相互作用促进小胶质细胞激活、中性粒细胞趋化以及神经功能恶化，通过使用Fpr1 抑制剂，证实了抑制Fpr1 能够减轻脑出血后小胶质细胞的活化和脑水肿等继发性损伤，提示Fpr1 在中枢神经系统疾病中扮演着重要角色。在创伤性脑损伤模型中，Fpr1可以激活MAPKs、NF-κB 等信号通路，促进炎性小体的激活，加重机体的氧化应激［10］。在胶质母细胞瘤患者中，Fpr1 高表达，并与AKT 和ERK 等通路密切相关［23］。对于Fpr1 的细胞定位，有研究［24］指出，通过对人神经组织进行单细胞测序发现，Fpr1 是特异性表达在小胶质细胞的标志基因。Li 等［8］在脑出血疾病模型中证实Fpr1 主要表达在小胶质细胞。Schröder 等［25］在阿尔茨海默病的相关研究中发现，抑制Fpr1 能够减轻小胶质细胞的激活，而对星形胶质细胞无影响，也侧面证实了Fpr1 主要表达在小胶质细胞。因此，本研究组猜测Fpr1 可能参与SCI 后小胶质细胞的激活，抑制Fpr1 能够减轻SCI 后的炎性反应。Xia 等［26］的研究表明，NLRP3 炎性小体作为固有免疫的重要组分，在机体先天性免疫反应和炎性反应发生过程中具有重要作用，其介导的Caspase-1 激活能够切割IL-1β 和IL-18 的前体，进而产生相应的成熟细胞因子，诱导细胞调亡。Jiang等［27］的研究表明，在SCI 急性期，抑制NLRP3 炎性小体的激活和小胶质细胞的活化，有利于减轻机体继发炎性反应和胶质瘢痕的产生，并促进轴突生长。因此，NLRP3 可作为治疗SCI 的潜在靶点。本研究组通过蛋白质印迹检测以及免疫荧光染色等实验验证了Fpr1 在SCI 后小胶质细胞中表达显著增加，抑制Fpr1 能够减少小胶质细胞的激活以及炎性因子的产生，并减少NLRP3 炎性小体的形成，推测Fpr1可能是SCI 治疗的重要靶点。

综上所述，本研究以Fpr1 为出发点，利用小鼠SCI 模型，为SCI 后减轻小胶质细胞诱导的神经炎性反应提供了一个新的治疗途径，也为HCH6-1 的临床应用转化提供了理论支持。