不同年龄段小鼠小脑浦肯野细胞胞体和树突形态的分析

裴 沛, 汤正权

(安徽大学生命科学学院, 合肥 230601)

神经元是神经系统结构和功能的基本单位,由胞体、树突和轴突构成。1个神经元可以有1个或多个树突,树突接受来自其他神经元的信息输入,随后传输给胞体,再到轴突,可起到联络神经的作用。树突分支的大小、密度和几何形状决定了与传入轴突形成的突触连接类型和数量[1]。小脑浦肯野神经元胞体呈梨形,顶端发出2～3条粗大的主树突。浦肯野细胞树突形态是脊椎动物中枢神经系统中最显眼的神经元树突形态,因其具有特征性的平面扇形枝晶,枝晶分支广泛且几乎填满空间没有重叠。这种树突形态非常适合接收来自十万多个平行纤维兴奋性突触输入,并与平行纤维呈正交形态分布[2]。浦肯野细胞树突的特殊形状分布为分析神经元树突的形态和发育提供了最佳模型[3]。小鼠浦肯野细胞在胚胎时第10至13天从心室区出现,在16至17天时迁移至小脑皮层。迁移后的浦肯野细胞呈现梭形形状,并带有一些原始的顶端树突。出生后小鼠浦肯野细胞形态发育具有3个特征阶段:从P0到P9的快速体细胞生长期,从P9到P18的快速树突生长期,以及P18之后的缓慢树突生长期直至成年[4]。浦肯野细胞树突在出生后3周内延伸、分支并与平行纤维、攀缘纤维中间神经元形成突触。浦肯野细胞树突形态发生的特征之一是初级树突的延伸和收缩。与成熟的浦肯野细胞相比,未成熟的浦肯野细胞在小鼠出生后第1周有几个初级树突。在出生后第2周,大多数浦肯野细胞失去初级树突。因此,浦肯野细胞树突的形态在出生后小脑发育过程中发生了显著变化[5]。浦肯野细胞似乎对衰老相当敏感,在衰老过程中表现出形态和功能的显著变化,如细胞数量减少、体细胞萎缩、树枝状树突收缩、亚细胞器退化、突触密度下降、神经递质系统紊乱和电生理特性的改变[6]。浦肯野细胞广泛分布于小脑皮层区域,在小脑4&5cb、Sim、Crus1和Crus2区域皆存在表达。此分区方式参考文献[7]。Crus 1和Crus 2区域在小脑后半球中占很大比例,在认知、记忆、词汇习得和言语检索、大脑执行控制环路等方面发挥作用[8]。尽管目前已知浦肯野细胞形态在发育阶段存在变化,但随年龄段变化时其形态功能变化尚不完全清楚。本文旨在研究浦肯野细胞在不同年龄段小鼠小脑内的形态变化,利用小白蛋白(parvalbumin, PV)作为浦肯野细胞标记物,对不同年龄段小鼠小脑中小白蛋白进行免疫荧光染色,观察浦肯野细胞胞体和树突形态[9]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

C57BL/6J小鼠购自合肥青源生物科技有限公司,共20只,雌雄各半。随机挑选14天龄、1月龄、2月龄、1年龄共4组年龄段小鼠,每组5只,每组小鼠体重差别在5 g以内。实验动物饲养于安徽大学动物房,其饲养遵循小鼠正常生长所需条件,恒温20 ℃,光照12 h与黑暗12 h交替。所有动物程序均符合安徽大学动物伦理委员会的相关规定(2020—039)。

1.2 方法

1.2.1 心脏灌注

戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射于小鼠体内使其深度麻醉,用镊子夹脚趾没有收缩反应后,剪开小鼠胸腔与腹腔,暴露其心脏。将吸有1×PBS的针管从小鼠左心室中插入,缓慢将1×PBS灌入心脏,剪开右心房使1×PBS排出。持续灌注1×PBS直至小鼠肝脏完全变白,随后将1×PBS换成4% PFA继续灌注,待小鼠尾巴与四肢僵硬后停止灌注,随后分离脑组织。

1.2.2 组织处理

将心脏灌注后分离的脑组织用4% PFA于4 ℃固定过夜,随后用15%蔗糖溶液(50 mL)于4 ℃脱水48 h,继续用30%蔗糖溶液(50 mL)于4 ℃脱水72 h。固定脱水完成后放置冷冻切片机(CM1900,Leica)中切片,切片厚度为40 μm,收集Bregma -6.72至Bregma -5.68之间的小脑切片。

1.2.3 免疫荧光

将小脑脑片浸泡于1×PBS中,用1×PBS冲洗3次,每次10 min后加入封闭液(5% BSA、0.5% TritonX-100、94.5% PBS)常温封闭1 h,随后用PV一抗(1∶600,parvalbumin antibody-195002,synaptic system,德国)4 ℃孵育24 h过夜。一抗孵育完成后用1×PBS冲洗3次,每次10 min,随后用PV二抗(1∶800,IgG488,A24221,Abbkine,中国武汉)室温避光孵育1.5 h,后用1×PBS冲洗3次,每次10 min。完成后将小脑脑片置于载玻片上,待1×PBS干透后滴入抗荧光淬灭剂(7 μL),用盖玻片轻放于载玻片上,避光静止5 min后用甲油封锁载玻片边缘防止空气进入。

1.2.4 共聚焦显微镜拍摄

用Olympus vs200 AW和Olympus spin sr拍摄20×、40×和100×的小脑脑片,固定值为120～40,光源470,曝光强度4 %,曝光时间75 ms。

1.2.5 统计分析

数据以平均值±标准误表示。使用OlyVIA、Origin等软件进行单因素方差分析与非参数检验分析,统计结果使用Origin软件作图,P<0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同年龄段小鼠小脑4&5cb、Sim、Crus1和Crus2分区中浦肯野细胞胞体大小和树突长度的比较

对14天龄、1月龄、2月龄、1年龄小鼠小脑4个分区4&5cb、Sim、Crus1和Crus2浦肯野细胞表达的小白蛋白(PV)进行免疫荧光染色,检测并比较浦肯野细胞树突长度、浦肯野细胞胞体面积[图1 (a)]。研究发现:4个年龄段中4&5cb区域树突长度显著低于其他3个区域(P<0.05),见图1(c)～图1(f);4&5cb区域胞体面积显著小于Sim区域(P<0.05),见图1 (c)～图1(f)。结果表明4&5cb区域浦肯野细胞胞体面积及树突发育水平较低。

(a)小鼠小脑浦肯野细胞PV免疫荧光染色图,本图选取2月龄小鼠为例;(b)小鼠小脑4个分区浦肯野细胞PV免疫荧光染色情况,年龄段为2月龄,左图从上至下分区为4&5cb、sim、Crus1和Crus2,右图箭头标注为浦肯野细胞胞体;(c)～(f)小脑4个分区浦肯野细胞树突长度与细胞面积统计图,年龄段从左至右分别为14天龄、1月龄、2月龄和1年龄。* 为P<0.05,** 为P<0.01,*** 为P<0.001。图1 4组年龄段小鼠小脑不同分区浦肯野细胞分析Figure 1 Analysis of Purkinje cells in different regions of mice cerebellum in four age groups

2.2 小鼠小脑浦肯野细胞树突长度及胞体面积随年龄段变化趋势

将小鼠小脑浦肯野细胞的树突长度、胞体面积在不同年龄段之间横向比较(图2),发现2月龄小鼠小脑浦肯野细胞树突长度显著高于1月龄与1年龄小鼠(P<0.05),见图2(d);1年龄小鼠小脑浦肯野细胞树突长度显著低于14天龄、1月龄、2月龄小鼠(P<0.05),见图2(d)。小鼠小脑浦肯野细胞树突长度从14天至2月龄整体呈上升趋势,2月龄后整体呈下降趋势[图2(b)],揭示浦肯野细胞树突生长随年龄存在先升高后下降的变化趋势。浦肯野细胞胞体面积从14天龄至1年龄则整体呈现下降趋势[图2(e)]。

(a) 4组年龄段小鼠小脑4&5cb、sim、Crus1和Crus2 4个区域浦肯野细胞PV免疫荧光染色;(b)～(e)浦肯野细胞树突长度和胞体面积随年龄变化趋势。* 为P<0.05,** 为P<0.01,*** 为P<0.001。图2 4组年龄段小鼠小脑浦肯野细胞形态分析Figure 2 Morphological analysis of Purkinje cells in mice cerebellum of four age groups of mice

2.3 不同年龄段小鼠小脑浦肯野细胞胞体和树突PV表达水平的比较

分析不同年龄段小鼠小脑4个分区中浦肯野细胞胞体和树突中小白蛋白(PV)平均荧光强度,荧光强度结果如图3所示。将不同年龄段间浦肯野细胞胞体、树突荧光强度横向比较,见图4,发现小鼠小脑胞体PV表达水平皆强于树突PV表达水平(P<0.05),见图4(a);1年龄小鼠小脑浦肯野细胞树突PV表达量较其他年龄段显著性升高(P<0.05),见图4(c)和(e);但1年龄小鼠小脑浦肯野细胞树突长度却显著性降低,故推测PV在浦肯野细胞树突的表达可能与浦肯野细胞树突生长存在拮抗作用。

(a)～(d) 4个年龄段小鼠小脑不同区域浦肯野细胞PV表达情况及其平均荧光强度比较。* 为P<0.05,** 为P<0.01,*** 为P<0.001。图3 4组年龄段小鼠小脑浦肯野细胞PV荧光强度比较Figure 3 Comparison of PV fluorescence intensity of cerebellar Purkinje cells in mice of four age groups

(a)小鼠小脑不同区域浦肯野细胞胞体和树突PV平均荧光强度比较;(b)～(e) 4个年龄段小鼠小脑浦肯野细胞胞体和树突PV平均荧光强度比较。* 为P<0.05,** 为P<0.01,*** 为P<0.001。图4 4组年龄段小鼠小脑浦肯野细胞PV荧光强度分析Figure 4 Analysis of PV fluorescence intensity of cerebellar Purkinje cells in mice of four age groups

3 讨论

本研究利用PV免疫染色方法,分析不同年龄段小鼠小脑4&5cb、Sim、Crus1和Crus2区域浦肯野细胞发育情况,发现浦肯野细胞在小脑不同分区存在明显差异,4&5cb区域浦肯野细胞树突长度低于其他区域,2月龄小鼠浦肯野细胞树突长度高于其他年龄组,浦肯野细胞面积随小鼠年龄升高而降低。同时比较PV在小鼠小脑浦肯野细胞内的荧光表达,结果表明PV在浦肯野细胞树突上表达随年龄段先降低后升高,1年龄小鼠PV表达最强烈。

已有研究表明浦肯野细胞在小脑堆积密度方面表现出明显的区域差异性,小脑叶基部浦肯野细胞比顶端少,前叶的堆积密度大于后叶[10],进一步证实浦肯野细胞发育的分区差异。已知浦肯野细胞产生两种不同类型的动作电位,浦肯野细胞区域差异性的存在可导致其连接的平行纤维密度存在差异,从而在功能上影响放电程度[11]。后续可从放电程度方面探究浦肯野细胞在4个分区上的差异性,以寻求不同分区上浦肯野细胞功能变化。关于浦肯野细胞随年龄段生长所呈现的发育变化,已有研究表明小脑浦肯野细胞在年龄段中呈现不同生长状态,浦肯野细胞在出生后第3周经历动态树突重塑[12]。另有研究表明浦肯野细胞总分支长度随年龄段升高而降低,每个浦肯野细胞上的总树突表面积和树突棘总数在20日龄达到高峰后随年龄的增长而下降[13]。树突生长受到突触形成的稳态调控,突触的形成在早期促进树突生长,但在后期抑制树突的生长[14]。本研究针对浦肯野细胞树突长度和细胞面积着手研究,对浦肯野细胞突触和树突生长之间的关系有待进一步论证。关于PV对浦肯野细胞发育的影响作用,有研究表明PV和钙结合蛋白D-28K的缺失导致浦肯野细胞脊柱长度加倍、体积与表面积增加以及更聚集的脊柱分布[15]。这与本研究PV表达升高时浦肯野细胞树突长度降低吻合,支持PV对浦肯野细胞发育存在拮抗作用的猜想。另有研究在野生型小鼠和PV敲除鼠的中间神经元-浦肯野细胞的配对记录中发现PV能有效地调节短期突触可塑性[16]。

目前浦肯野细胞发育随年龄段变化的作用机制尚未清晰。研究表明雌二醇通过小脑中脑源性神经营养因子作用,诱导发育中的浦肯野细胞树突生长、树突棘发生和突触发生[17]。同时星形胶质细胞可调节浦肯野细胞轴体和轴棘突触的数量,诱导浦肯野细胞树突棘增殖,促进浦肯野细胞结构和功能成熟[18]。另外线粒体途径可能有助于浦肯野细胞的形态发育[19]。

本研究针对浦肯野细胞形态发育变化和PV表达变化,阐明小鼠浦肯野细胞树突随年龄段增加呈现先升高后降低趋势,浦肯野细胞胞体大小随年龄段增加逐渐减小。PV表达随年龄段增加呈现升高趋势,引发PV对浦肯野细胞生长存在拮抗作用的猜想,为后续浦肯野细胞研究奠定基础,但对浦肯野细胞发育的功能机制研究尚未清晰,需进一步研究论证。