HPLC法测定溴芬酸钠滴眼液中聚合物的含量

吴永芹 薛 雯 孟 龙 王 军 韩 勇 张 莹

1.山东省济宁市食品药品检验检测研究院，山东济宁 272073；2.山东省食品药品审评查验中心，山东济南 250014

溴芬酸钠,即[2-氨基-3-（4-溴苯甲酰基）苯基]乙酸钠，其制剂0.1%溴芬酸钠滴眼液于2000年在日本上市，于2015年在国内批准生产上市。0.1%溴芬酸钠滴眼液临床应用较广，主要用于外眼部及前眼部的炎症的治疗，如眼部手术后的炎症、结膜炎等症状，其作用强度是其他非甾体抗炎药的十倍，临床效果显著[1-6]。配方中的增稠剂聚维酮K30在储存过程中与溴芬酸钠发生聚合反应，生成聚合物杂质U-Ⅱ，会降低主药含量，同时使药液黏性下降，疗效降低，聚合物杂质U-Ⅱ的产生同时增加了使用过程中的不良反应发生风险。本研究建立HPLC对溴芬酸钠滴眼液中产生的聚合物的含量进行测定，为控制其药品质量提供方法依据。

1 仪器与试药

LC-2030C型高效液相色谱仪（DAD检测器）（日本岛津）；流动相吸附柱（4.6 mm×50 mm）（中谱科技），色谱柱：Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；TE214S型电子天平、BS21S型电子天平[赛多利斯科学院仪器（北京）有限公司]；FE28酸度计（梅特勒-托利多仪器有限公司）、磷酸氢二钾（天津市光复精细化工研究所，优级纯）；乙腈（天津四友，HPLC级）；磷酸（阿拉丁，HPLC级）；超纯水（实验室自制，电阻率18.2 MΩ）；溴芬酸钠对照品（LGC，W1008660）；聚维酮对照品（中检院，批号：190070-201501），溴 芬 酸 钠 滴 眼 液[批 号：0A0021M10、0A0011M10（A厂 家），1907033101、1907053101、1912073102、2001013101、2001033101、2006043101、2007063101、2007083101（B厂家），P432（C厂家）]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相A为0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液（pH 4.5）-乙腈（75∶25），流动相B为乙腈；梯度洗脱：0～5 min（0%B），5～10 min（0%→28%B），10～30 min（28%B），30～30.1 min（28%→0%B），30.1～60 min（0%B）；柱温30℃，流速1.0 ml/min，检测波长400 nm，进样量20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取溴芬酸钠对照品10.01 mg，置100 ml棕色量瓶中，加入30 ml流动相A，振摇使对照品溶解，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液①，精密量取1 ml，置100 ml棕色量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取溴芬酸钠滴眼液2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加入流动相A振摇并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 聚维酮K30阴性对照溶液的制备 制备不含聚维酮K30的阴性供试品，精密量取2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加流动相A振摇并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 聚维酮K30对照溶液的制备 取聚维酮K30原料，加流动相A制成浓度为2 mg/ml的溶液。精密量取2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加流动相A振摇并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 专属性试验考察

精密吸取上述溶液各20 μl进样测定，见图1，结果表明，聚合物峰与相邻色谱峰分离良好，出峰时间约为10 min，阴性对照无干扰，在400 nm波长处聚维酮K30无吸收，对聚合物的测定无干扰。

图1 专属性试验色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密量取2.2.1下不同体积的对照品溶液①，置50 ml棕色量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，制备得到浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml的系列标准溶液，精密吸取20 μl，进样测定，以浓度C（μg/ml）为横坐标，峰面积A（μv·ms）为纵坐标作图，得到其回归方程为A=11463.95C-130.90，r=0.9995，结 果 表 明 在 进 样 量 为20 μl时，在0.1～10.0 μg/ml浓度范围内，线性关系良好。见图2。

图2 线性关系曲线图

2.5 精密度试验

精密量取对照品溶液（浓度为1 μg/ml），进样6次，峰面积（μv·ms）分别为14 484、14 433、14 459、14 535、14 499、14 382，RSD为0.38%。取 供试品溶液，重复进样6次，峰面积（μv·ms）分别为14 753、14 684、14 293、14 574、14 154、14 982，RSD为2.1%。试验结果表明，仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

考察溶液24 h稳定性，峰面积（μv·ms）分别为18 468（0 h）、17 463（2 h）、18 132（4 h）、18 088（8 h）、16 268（12 h）、12 543（24 h），结果样品溶液在8 h内稳定，8 h内RSD为2.9%。

2.7 重复性试验

取溴芬酸钠滴眼液，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，共6份，进样测定，峰面积（μv·ms）分别为13 489、13 198、13 734、13 216、13 324、13 148，以峰面积计算，RSD为1.7%，试验结果表明，样品的重复性试验良好。

2.8 检出限和定量限

取溴芬酸钠对照品溶液，逐步稀释，按照信噪比S/N=3确定检出限溶液的浓度，检出限溶液浓度为0.02 μg/ml，按照信噪比S/N=10确定定量限溶液的浓度，定量限溶液浓度为0.05 μg/ml。将供试品溶液稀释5倍，精密吸取20 μl，进样测定，色谱图中聚合物峰的信噪比S/N=10，计算聚合物含量，定量限浓度相当于溴芬酸钠标示量的0.03%。

2.9 测定结果

按照建立的测定方法，测定三个厂家的11批样品，聚合物含量按照溴芬酸钠标示量计算，结果范围为0.1%～1.5%，分别按照各自现行法定标准进行测定，结果范围为0.1%～3.2%，聚合物测定结果见表1。

表1 聚合物测定结果（n=3）

3 讨论

本研究考察了不同pH值的0.1%三乙胺-乙腈体系、不同pH值的0.0025 mol/L庚烷磺酸钠-乙腈体系、不同pH值的0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液-乙腈体系；考察了C8色谱柱、C18色谱柱、凝胶色谱柱G-10、TSKgel SuperMultiporePW-M尺寸排阻色谱柱；考察了蒸发光散射检测器、紫外检测器、示差折光检测器。当采用C18色谱柱，紫外检测器，以0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液-乙腈体系为流动相时，聚合物与其他组分分离效果最好，可以进行准确定量。由于聚维酮K30为大分子物质，在C18色谱柱上出峰峰型较宽，且在色谱柱有残留，需提前进行色谱柱的饱和[7-17]。

聚合物是溴芬酸钠与聚维酮K30在药品的储存期间聚合产生的，无法分离纯化得到聚合物杂质纯品，市面上无聚合物杂质对照品出售，无法用对照品进行定量。现行国内外标准中聚合物的计算方式，采用样品峰面积直接扣除空白溶液中聚维酮K30峰面积，取峰面积差值，按外标法进行计算。聚维酮K30对照品的称样量或者峰面积值大小直接影响计算结果，甚至会出现负值，测定结果与聚维酮K30投料的多少和聚维酮K30对照品取样量的多少直接相关，存在监控风险。经比较分析溴芬酸钠对照品和聚维酮K30原料的紫外吸收光谱图，溴芬酸钠在400 nm波长处有较大的吸收，而聚维酮K30在400 nm波长处无紫外线吸收，不影响聚合物的定量，故检测波长选择为400 nm。

现行标准方法的供试品色谱图中聚合物峰型极不规则，基线不平，且计算方式不合理，含量测定的结果不准确，测定结果值差异较大。本研究选择在无干扰的400 nm波长处采集信号，以外标法直接计算含量，与现行标准方法比较，结果更准确可靠。但由于各个批次供试品聚合物的形成具有不确定性，结果差异也较大。

本研究建立了溴芬酸钠滴眼液中聚合物的含量测定方法，方法简便、快速，可用于控制溴芬酸钠滴眼液聚合物的含量，也为其质量控制方法的研究提供了参考。