金莲花多糖提取工艺优化及其抗氧化活性评价

李春晓,宋庆琳,焦旭,冯慧程,陈虞超,郭生虎,张波,薛涛

(1.临沂大学医学院,山东 临沂 276000;2.宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏 银川 750002)

金莲花为毛茛科植物金莲花(TrolliuschinensisBunge)的干燥花及其花蕾,传统医学认为金莲花具有清热解毒、消肿明目等功效[1],而现代药理学研究证实金莲花具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗衰老等多种药理活性[2]。金莲花多以金莲花片、金莲花颗粒、金莲花胶囊、金莲花口服液等中成药形式在临床中使用,主要用于治疗上呼吸道感染及各种炎症[2];作为食用,金莲花多以花茶的形式以供饮用[3]。如今,金莲花在新疆、黑龙江、宁夏、河北、陕西等地均有栽培。

金莲花含有黄酮类、有机酸类、生物碱类、香豆素类及多糖类化学成分,其中黄酮类成分研究最为广泛,而多糖类成分研究相对较少[4]。然而,多糖类成分是中药化学成分的重要组分之一,具有抗氧化[5]、抗病毒[6]、抗衰老[7]、抗肿瘤[8]、降血糖[9]、降血脂[10]、增强免疫[11]等广泛的药理活性,开发利用前景广阔。因此,本研究采用回流提取法提取金莲花多糖,在单因素试验的基础上,采用正交设计试验优化了金莲花多糖的提取工艺,并对金莲花多糖的体外抗氧化活性进行了全面评估,以期为金莲花多糖的进一步研究与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器金莲花购自宁夏银川永宁县,经郭生虎教授鉴定为毛茛科植物金莲花(TrolliuschinensisBunge)的干燥花;葡萄糖对照品购自上海源叶生物科技有限公司;抗坏血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)、过硫酸钾、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、邻苯三酚、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、水杨酸、七水合硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸均购自上海麦克林生化科技有限公司;氯化钠、磷酸氢二钠、十二水合磷酸二氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司。

FA1204N型电子分析天平(上海菁海仪器有限公司);DHG-9620A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHK-Ⅲ型循环水式真空泵(郑州科泰实验设备有限公司);GL-21M型高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司);UV-5500紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理取金莲花样品置鼓风干燥箱中,50 ℃烘干24 h后粉碎,过60目筛,备用。

1.2.2 金莲花多糖的提取准确称取金莲花粉末10 g置250 mL圆底烧瓶中,加入一定量的蒸馏水,在一定温度下加热回流提取一定时间,过滤,旋转蒸发浓缩至50 mL,冷却后加入4倍体积的无水乙醇,4 ℃静置过夜,5 000 r·min-1离心10 min,获得多糖后于烘箱中80 ℃烘干,即得。

1.2.3 金莲花多糖的含量测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制精密称取0.50 g葡萄糖对照品配制成浓度为的1 mg·mL-1的对照品溶液;精密量取葡萄糖对照品溶液0、20、40、60、80、100、120 μL置试管中,并用蒸馏水补足至1.0 mL;向各试管中分别加入5%苯酚溶液0.5 mL,浓硫酸2.5 mL,摇匀,静置20 min;以水为参比,照《中国药典》紫外-可见分光光度法(通则0401)[12],在490 nm波长下测定吸光度,以吸光度为纵坐标Y,葡萄糖浓度为横坐标X(mg·mL-1),获得标准曲线方程为Y=15.696X-0.026 5,R2=0.996 6,线性范围0.02～0.12 mg·mL-1。

1.2.3.2 多糖得率计算金莲花多糖经回流提取浓缩后,按照“1.2.3.1”项下方法进行测定,将获得的吸光值代入标准曲线方程计算出金莲花多糖溶液的浓度,并根据以下公式进行计算:

式中:N为金莲花多糖得率(%);C为金莲花提取液中多糖浓度(mg·mL-1);V为金莲花多糖提取液体积(mL);B为稀释倍数;W为金莲花样品质量(g)。

1.2.4 单因素试验

1.2.4.1 提取温度对金莲花多糖提取率的影响按照“1.2.2”项下方法进行操作,固定料液比为1∶25(m/V),提取时间为2.5 h,分别设置60、70、80、90、100 ℃等不同提取温度以考察提取温度对金莲花多糖提取率的影响。

1.2.4.2 料液比对金莲花多糖提取率的影响按照“1.2.2”项下方法进行操作,固定提取温度为80 ℃,提取时间为2.5 h,分别按照1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(m/V)等不同料液比进行提取,以考察料液比对金莲花多糖提取率的影响。

1.2.4.3 提取时间对金莲花多糖提取率的影响按照“1.2.2”项下方法进行操作,固定料液比为1∶25(m/V),提取温度为80 ℃,分别设置1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h等不同提取时间,以考察提取时间对金莲花多糖提取率的影响。

1.2.5 正交试验设计在单因素试验的基础上,选取料液比、提取温度、提取时间3个影响因素为自变量,以金莲花多糖提取率为指标,进行三因素三水平正交试验设计,L9(33)正交试验设计如表1所示。

表1 L9(33)正交试验设计

1.2.6 体外抗氧化活性评价

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力的测定参照刘宇等[13]的方法进行测定。首先,用蒸馏水将金莲花多糖倍半稀释成系列浓度(2.0、1.0、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03 mg·mL-1);然后,向10 mL比色管中分别加入2 mL不同浓度的金莲花多糖样品,加入2 mL 0.1 mmoL·L-1DPPH乙醇溶液,混匀,室温避光反应30 min,离心(3 000 r·min-1,10 min)后于517 nm测定吸光值。DPPH自由基清除率按下式计算,其中A0为空白对照吸光值,反应体系中以无水乙醇代替被测样品;As为样品吸光值;As0为样品本底吸光值,反应体系中以无水乙醇代替DPPH。以相同浓度的抗坏血酸为阳性对照。不同浓度的金莲花多糖样品及抗坏血酸阳性对照均重复测定3次。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力的测定参照刘旭东等[14]的方法进行测定。将2.45 mmoL·L-1过硫酸钾溶液与7 mmoL·L-1的ABTS+溶液,等体积混合后,室温避光孵育12～16 h,获得ABTS+储备液。取适量ABTS+储备液通过PBS缓冲液(0.01 moL·L-1,pH 7.5)稀释至在734 nm下的吸光值为0.7左右即得到ABTS+工作液。取不同浓度(0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008 mg·mL-1)的金莲花多糖溶液0.2 mL,加入3.8 mL的ABTS+工作液,混匀后室温反应6 min并于734 nm下测定吸光值。ABTS+自由基清除率按下式计算,其中A0为空白对照吸光值,反应体系中以蒸馏水代替被测样品;As为样品吸光值;As0为样品本底吸光值,反应体系中以蒸馏水代替ABTS+工作液。以相同浓度的抗坏血酸为阳性对照。不同浓度的金莲花多糖样品及抗坏血酸阳性对照均重复测定3次。

1.2.6.3 羟基自由基清除能力的测定采用水杨酸法测定金莲花多糖对羟基自由基的清除能力。先用蒸馏水将金莲花多糖倍半稀释成系列浓度(0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008 mg·mL-1)。然后向10 mL离心管中依次加入6 mmoL·L-1硫酸亚铁1 mL,不同浓度的金莲花多糖样品溶液1 mL,6 mmoL·L-1H2O21 mL,混匀,室温放置10 min,最后加入6 mmoL·L-1乙醇-水杨酸,摇匀,在37 ℃恒温箱放置20 min,于510 nm处测定吸光值。羟基自由基清除率按下式计算,其中A0为空白对照吸光值,反应体系中以蒸馏水代替被测样品;As为样品吸光值;As0为样品本底吸光值,反应体系中以蒸馏水代替H2O2。以相同浓度的抗坏血酸为阳性对照。不同浓度的金莲花多糖样品及抗坏血酸阳性对照均重复测定3次。

1.2.6.4 超氧阴离子自由基清除能力的测定采用邻苯三酚法测定金莲花多糖对超氧阴离子自由基的清除能力。先用蒸馏水将金莲花多糖倍半稀释成系列浓度(4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.13、0.06 mg·mL-1)。然后向10 mL离心管中依次加入0.1 moL·L-1Tris-HCl溶液4.5 mL,蒸馏水2.4 mL,不同浓度的金莲花多糖样品溶液1 mL,混匀后室温反应10 min,加入0.1 mL 10 mmoL·L-1HCl终止反应,于325 nm测定吸光值。超氧阴离子自由基清除率按下式计算,其中A0为空白对照吸光值,反应体系中以蒸馏水代替被测样品;As为样品吸光值;As0为样品本底吸光值,反应体系中以蒸馏水代替邻苯三酚。以相同浓度的抗坏血酸为阳性对照。不同浓度的金莲花多糖样品及抗坏血酸阳性对照均重复测定3次。

1.2.6.5 总还原能力的测定先用蒸馏水将金莲花多糖倍半稀释成系列浓度(4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.13、0.06 mg·mL-1)。然后向10 mL离心管中依次加入不同浓度的金莲花多糖样品溶液0.5 mL,磷酸缓冲液(0.2 moL·L-1,pH 6.6)2.5 mL和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL。充分混匀后将混合物置于水浴锅中水浴20 min (50 ℃)。再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,混匀后室温静置10 min。从上述试管中取出2.5 mL反应液,依次加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%氯化铁溶液,反应10 min后,以蒸馏水调零,测定700 nm处吸光值。以相同浓度的抗坏血酸为阳性对照。不同浓度的金莲花多糖样品及抗坏血酸阳性对照均重复测定3次。

1.3 数据分析采用Excel进行数据统计与分析;采用Origin Pro 9.0 2016 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 金莲花多糖提取单因素试验结果

2.1.1 提取温度对金莲花多糖提取率的影响在60～100 ℃范围内,随着提取温度的升高,金莲花多糖的提取率也逐渐提高,由最低的0.274%提升至最高的0.769%。且在60～70 ℃及70～80 ℃范围内金莲花多糖提取率的上升幅度(斜率)明显小于80～90 ℃时的金莲花多糖提取率的上升幅度,说明在80 ℃时金莲花多糖的提取率开始显著提升。因此,在后续的正交试验设计中选用80、90和100 ℃作为提取温度的3个水平。

2.1.2 料液比对金莲花多糖提取率的影响当料液比在1∶10～1∶30(m/V)范围内时,金莲花多糖提取率呈现先增高后降低的趋势,且当料液比为1∶25时,金莲花多糖提取率达到0.790%,且显著(P<0.05)高于1∶20和1∶30料液比时的多糖提取率。因此,在后续的正交试验设计中选用1∶20、1∶25、1∶30作为料液比的3个水平。

2.1.3 提取时间对金莲花多糖提取率的影响在1.0～3.0 h范围内,金莲花多糖的提取率随着提取时间的延长呈现出先提高后降低的趋势,且在提取时间2.0 h的时候达到峰值,此时提取率为1.230%。虽然继续延长提取时间,但金莲花多糖的提取率不升反降,但与1.0 h相比,金莲花多糖的提取率仍有显著提高(P<0.05)。因此,在综合考虑提取率与时间成本的情况下,后续的正交试验设计中选用了1.5、2.0和2.5 h作为提取时间的3个水平。

2.2 金莲花多糖提取条件正交设计试验结果根据单因素试验的结果,选取了料液比、提取温度和提取时间3个因素及对应的3个水平以设计L9(33)正交试验,试验以金莲花多糖提取率为指标。结果如表2和表3所示,通过极差分析可知,在3个影响因素中,提取温度的影响最大,料液比的影响次之,提取时间的影响最小。

表2 L9(33)正交试验分析结果

表3 正交试验方差分析

通过正交试验结果分析可知,当以金莲花多糖提取率为评价指标时所获得的最佳提取工艺组合为A1B2C2,即提取温度80 ℃,料液比为1∶25(m/V),提取时间为2.0 h。为进一步验证最佳提取工艺的提取效果,本研究按照最佳工艺组合再次平行提取了3份金莲花多糖,结果金莲花多糖提取率为1.350%±0.125%,说明本研究优化的提取工艺对金莲花多糖的提取效果稳定可靠。

2.3 金莲花多糖体外抗氧化活性评价结果

2.3.1 金莲花多糖对DPPH自由基清除作用在0.03～0.25 mg·mL-1浓度范围内,金莲花多糖对DPPH自由基清除率逐渐升高,量效关系明显。浓度在0.25～2.0 mg·mL-1范围内金莲花多糖对DPPH自由基的清除率趋于稳定,在72.43%～76.50%之间。与之相比,抗坏血酸对DPPH自由基的清除效果优于金莲花多糖,当抗坏血酸浓度在0.06 mg·mL-1以上时其对DPPH自由基的清除率均高于96.10%。金莲花多糖对DPPH自由基清除作用的50%抑制浓度IC50为0.161 mg·mL-1。饶娜等[15]对金莲花多糖进行了梯度洗脱并制备了4个不同组分,而4个组分中仅有2个组分对DPPH自由基有清除作用,但清除效果并不高,在0.30 mg·mL-1时2个组分对DPPH自由基的清除率分别为35.5%和23.7%。

DPPH自由基清除实验测定多糖抗氧化活性时,由于DPPH的溶剂体系为乙醇,且整个反应体系完成后乙醇浓度较高,此时容易产生絮状沉淀(应为部分多糖醇沉析出),故在测定吸光值前应予以离心处理。但沉淀的产生是否影响结果的真实性仍有待研究,本研究认为DPPH自由基清除实验是否适用于多糖类成分的体外抗氧化能力测定亦有待商榷。

2.3.2 金莲花多糖对ABTS+自由基清除作用在0.008～0.50 mg·mL-1浓度范围内金莲花多糖对ABTS+自由基清除作用逐渐增强,且在0.50 mg·mL-1时最大清除率达到99.94%,此浓度下其对ABTS+自由基清除效果与抗坏血酸(清除率99.74%)相当。而抗坏血酸在0.008～0.125 mg·mL-1浓度范围内对ABTS+自由基清除作用逐渐增强,且呈浓度相关性;在0.125 mg·mL-1以上时,其清除效果趋于稳定,对ABTS+自由基的清除率在99.74%～99.87%之间。金莲花多糖对ABTS+自由基清除作用的IC50为0.079 mg·mL-1。

2.3.3 金莲花多糖对羟基自由基清除作用在0.008～0.031 mg·mL-1浓度范围内金莲花多糖对羟基自由基的清除率随着浓度的增加提升显著,而在0.031～0.50 mg·mL-1浓度范围内金莲花多糖对羟基自由基的清除率随着浓度的增加提升趋于平缓,但整体上呈剂量效应关系。在金莲花多糖浓度为0.50 mg·mL-1时,其对羟基自由基的清除效果最强,清除率达到94.76%。抗坏血酸在0.008～0.063 mg·mL-1浓度范围内,其对羟基自由基的清除效果随浓度提升增加显著,在0.063 mg·mL-1之后,清除效果提升减缓,且在0.125 mg·mL-1以后,抗坏血酸对羟基自由基的清除率稳定在99.21%±0.23%左右。金莲花多糖对羟基自由基清除作用的IC50为0.006 mg·mL-1。饶娜等[15]研究亦发现金莲花多糖对羟基自由基的清除能力较强,在0.30 mg·mL-1时金莲花多糖组分对羟基自由基的清除率可达到99.3%,该结果与本研究结果相似。

2.3.4 金莲花多糖对超氧阴离子清除作用金莲花多糖对超氧阴离子的清除效果相对较弱,在0.06～4.0 mg·mL-1浓度范围内,金莲花多糖对超氧阴离子的清除效果逐渐增强,且在4.0 mg·mL-1时,清除率为47.42%。与之相比,抗坏血酸对超氧阴离子的清除效果较强,在0.06～0.50 mg·mL-1浓度范围内其对超氧阴离子的清除率逐渐增强,而当浓度在0.50～4.0 mg·mL-1时,抗坏血酸对超氧阴离子的清除率为99.48%±0.09%。金莲花多糖对超氧阴离子清除作用的IC50为4.216 mg·mL-1。

2.3.5 金莲花多糖总还原能力测定结果同一浓度下,OD值越大说明总还原能力越强。金莲花多糖在0.06～4.0 mg·mL-1浓度范围内,OD值由0.21逐渐提升至2.78,除在1.0～2.0 mg·mL-1浓度范围内OD值提升较平缓外,在0.06～1.0 mg·mL-1和2.0～4.0 mg·mL-1浓度范围内OD值与浓度均具有较好的量效关系。在4.0 mg·mL-1时,金莲花多糖OD值达到2.78,与抗坏血酸相当(OD值为2.82)。抗坏血酸在0.06～0.50 mg·mL-1浓度范围内,OD值随浓度增加而逐渐增加,呈剂量效应关系;而在0.50～4.0 mg·mL-1范围内,OD值在2.72～2.82之间,差异无统计学意义。

3 结论

本研究通过正交试验设计优化了金莲花多糖的回流提取工艺,其最佳条件为料液比1∶25(m/V)、提取温度80 ℃、提取时间2 h,在此条件下金莲花多糖的提取率为1.350%±0.125%。然而,通过方差分析结果发现,本研究所选的3个单因素料液比、提取温度和提取时间对提取率均无显著性差异,其可能原因在于:①正交试验研究中的因素水平是根据单因素试验结果选择的,考虑到生产实际中的应用可能性,故未进行各因素水平的延伸;②更多潜在影响金莲花多糖提取率的因素应予以进一步研究,如提取次数、金莲花药材粉碎粒度大小等等。本研究所确立的最佳提取条件,提取率相对较高,可供参考。

通过IC50结果可知,金莲花多糖对羟基自由基清除作用(0.006 mg·mL-1)>对ABTS+自由基的清除作用>(0.079 mg·mL-1)>对DPPH自由基的清除作用(0.161 mg·mL-1)>对超氧阴离子的清除作用(4.216 mg·mL-1)。由于各抗氧化实验原理略有不同,各实验间IC50值有所差异,但IC50均≤4.216 mg·mL-1,说明金莲花多糖具有较强的抗氧化活性。尤其是对ABTS+自由基和羟基自由基的清除效果在4.0 mg·mL-1浓度时与抗坏血酸相当。抗氧化活性是药物发挥多种药效的常见作用机制之一,由于以上几种体外抗氧化活性实验的检测原理不同,其抗氧化能力的强弱也略有不同。但自由基的产生是导致机体氧化损伤的原因之一,且不同疾病的产生可能由不同的自由基诱导(如羟基自由基、超氧阴离子等),因此,本研究对金莲花多糖的体外抗氧化实验进行了多方位的检测,以便为后续相关药理作用研究提供数据参考。综上,本研究结果提示金莲花多糖是潜在的药理活性成分之一,为金莲花多糖的大量制备及开发利用提供了数据参考。