滇桂艾纳香提取物促进DUB大鼠子宫收缩机制分析

陈秀婷,韦玥吟,覃田田,吴超权,李宇清

(1.广西中医药大学药学院,广西 南宁 530200;2.广西壮族自治区食品药品检验所,广西 南宁 530200;3.广西中医药大学,广西高校中药药理重点实验室,广西 南宁 530200)

功能失调性子宫出血(DUB)是一种因神经内分泌系统功能失调所致疾病,多因神经内分泌失常或下丘脑-垂体-卵巢轴功能失常[1],机体排卵功能受到抑制而引起的子宫异常出血,是妇科临床常见病。DUB在中医学中属于“崩漏”疾病范畴,即经血非时暴下或淋漓不止[2]。在《中药新药临床研究指导原则》中将其描述为脾虚、血瘀等。临床上主要采用性激素、止血药物及调整周期等方法治疗DUB,但疗效不稳定,副作用大。中药对DUB的治疗具有多层次、多途径、多靶点的止血和调节作用,较西药具有其独特优势[3]。

滇桂艾纳香为菊科植物假东风草[Blumeariparia(Bl.)DC]的干燥全草,味淡、性平,归肝、脾经,具有活血化瘀、止血调经之功效。其为壮族民间草药,在广西具有悠久的使用历史,多用于妇女产后出血、血崩以及其他子宫出血等疾病[4]。现代药理学研究发现滇桂艾纳香除了有促凝血作用外,还能显著影响子宫的收缩能力,其在《中华药海》中有为“收敛止血,具有活血不伤血,止血不留瘀之功,可用于各种出血症”的描述。滇桂艾纳香的成药制剂妇血康颗粒在临床上用于治疗瘀血阻滞、月经过多、经期过长、产后恶露不绝等症[5],但由于活性成分尚未明确,作用机制尚未清晰,制剂标准较为落后,制约了临床推广与应用。

本文将通过利用米非司酮联合米索前列醇建立DUB大鼠模型,对滇桂艾纳香提取物治疗DUB的作用及其作用机制进行研究,为滇桂艾纳香在临床上的进一步推广提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物SPF级SD大鼠,雌鼠250～300 g,雄鼠300～350 g,由广西医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(桂)2014-0002。实验动物使用许可证:SYXK桂2019-0001。饲养于标准实验动物环境,实验全程除采样前禁食外,动物可自由摄取水和食物。本研究通过广西中医药大学动物伦理委员会审核批准,伦理审查证书编号:DW20190611-072,实验操作严格遵循动物福利相关规定。

1.2 实验药物及主要试剂滇桂艾纳香提取物(为滇桂艾纳香乙醇提取物,经乙酸乙酯萃取后,大孔树脂吸附,50%乙醇洗脱得到的提取物);咖啡酸(批号:MUST-19120802)、原儿茶酸(批号:MUST-19111305)、丁香酸(MUST-19111601)、没食子酸(批号:MUST-19122310)均购于成都曼思特生物科技有限公司;水杨酸(批号:Y-0670191201)、香草酸(批号:Y0670191022)均购于上海柏卡化学技术有限公司;益母草颗粒(昆明中药厂有限公司,批号:571138);米非司酮片(批号:190507)、米索前列醇(批号:190501)均购买于湖北葛店人福药业有限责任公司;全蛋白提取试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司;批号:20191106);钙离子检测试剂盒(杰赛博生物科技有限公司,批号:3GI270);蛋白激酶A(PKA)试剂盒(加拿大Immune Chem免疫化学药剂有限公司,批号:ICP0216);磷酸甘油酸脱氢酶(GADPM)兔单克隆抗体(批号:10)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)兔单克隆抗体(批号:4)、磷酸化-CREB兔单克隆抗体(批号:14)均购于Cell Signaling Technology公司;重组β2肾上腺素受体(β2AR)抗体[艾博抗(上海)贸易有限公司,批号:GR3232710-7];BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号:14F19B46)、HRP-羊抗兔 IgG(批号:BST14G29C54)均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 主要实验仪器BL-420F生物肌张力测定系统(成都泰盟软件有限公司);HW-400E恒温平滑肌槽(成都泰盟软件有限公司);PowerPac HC电泳槽[伯乐生命医学产品(上海)有限公司];LC-2030 Plus 高效液相色谱仪(日本株式会社岛津制作所)。

2 方法

2.1 滇桂艾纳香提取物有机酸含量的检测本课题组在前期研究中发现[6],滇桂艾纳香促进子宫收缩可能主要依托其中的有机酸类化学成分。本研究采用高效液相色谱(HPLC)法检测滇桂艾纳香提取物中的有机酸及其含量。色谱柱:Agilent 5 TC-C18色谱柱,流速:1 mL·min-1,柱温:30 ℃,进样量10 μL。根据外标法计算可知其所含有机酸及其含量为:没食子酸(0.037 8 mg·g-1)、原儿茶酸(0.333 2 mg·g-1)、香草酸(0.080 6 mg·g-1)。

2.2 动物分组及给药参考王晓东等[7-8]的实验方法,取性成熟未受孕的雌性与性成熟雄性SD大鼠1∶2合笼,次日上午对看到阴道栓的雌性大鼠进行阴道涂片检查,若发现精子及角化上皮细胞,则为妊娠第1天,如果未成功受孕,则继续合笼,直至发现阴道栓。于妊娠第7天灌胃米非司酮(8.3 mg·kg-1),10 h后灌胃米索前列醇(0.1 mg·kg-1)引起不完全流产模型,并向大鼠阴道内放置约60 mg医用棉球1枚,次日起分别于8∶00取出棉球见出血者即认为DUB模型建立,将成模的雌性大鼠随机分5组,每组8只,分别为正常妊娠组,DUB模型组,益母草颗粒3.125 g·kg-1组,滇桂艾纳香0.4 g·kg-1组,滇桂艾纳香0.2 g·kg-1组,另取8只未受孕性成熟雌性大鼠作空白对照。各组动物在造模后第2天按剂量灌胃相应药物,空白对照组、正常妊娠组及DUB模型组动物灌胃等量蒸馏水,灌胃每天1次,连续灌胃至妊娠第14天。

2.3 大鼠离体子宫平滑肌收缩能力测定末次灌胃给药1 h后,腹腔注射戊巴比妥钠(70 mg·kg-1)麻醉,将子宫从大鼠体内分离,置于恒温平滑肌槽的37 ℃洛氏液中,连接生物肌张力测定系统,给离体子宫加1.0 g的前负荷,待子宫收缩平稳后,记录8 min内子宫平滑肌的收缩曲线并读取最大收缩力、收缩频率。

2.4 DUB大鼠子宫组织中PKA激酶活性及Ca2+浓度的检测取100 mg大鼠子宫组织,与PBS按1∶10的比例进行匀浆,静置后离心取上清,分别按PKA活性检测试剂盒及Ca2+浓度检测试剂盒说明书要求进行测定。

2.5 Western blotting法检测DUB大鼠子宫中β2AR、CREB、p-CREB蛋白的表达根据全蛋白提取试剂盒提取大鼠子宫总蛋白,用BCA法测定蛋白含量。将蛋白样本变性、电泳、转膜后,分别使用β2AR(1∶2 000)、CERB(1∶1 000)、p-CREB(1∶800)、GAPDH(1∶3 000)一抗,4 ℃孵育过夜。后用HRP-羊抗兔 IgG(1∶10 000)置于摇床中室温孵育2 h,加入ECL试剂后进行显影。利用Image J软件分析条带灰度,以目的蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值,对目的蛋白进行相对定量。

3 结果

3.1 滇桂艾纳香提取物促进DUB大鼠子宫收缩如表1所示,与空白对照组相比,正常妊娠组大鼠子宫最大收缩力明显降低(P<0.01),收缩频率升高(P<0.05),DUB模型组大鼠子宫最大收缩力有所下降,收缩频率有所上升,但差异均无统计学意义。与DUB模型组相比,滇桂艾纳香0.2 g·kg-1组大鼠子宫收缩频率提高(P<0.05),但最大收缩力与DUB模型组大鼠没有统计学差异,其对子宫收缩的影响与益母草相似。

表1 滇桂艾纳香提取物对DUB大鼠子宫收缩的影响

3.2 滇桂艾纳香提取物降低DUB大鼠子宫平滑肌PKA激酶活力如表2所示,与DUB模型组相比,滇桂艾纳香0.4 g·kg-1组大鼠子宫平滑肌PKA活力水平下调(P<0.01);滇桂艾纳香0.2 g·kg-1组大鼠子宫平滑肌PKA水平也呈现下调趋势。

表2 滇桂艾纳香提取物对DUB大鼠子宫平滑肌PKA激酶活力的影响

如表3、图1所示,空白对照组的β2AR蛋白表达量较高,但DUB模型组及各个给药组动物子宫平滑肌β2AR表达量差异无统计学意义,滇桂艾纳香提取物不能明显影响子宫平滑肌β2AR蛋白的表达水平。

图1 滇桂艾纳香提取物对DUB大鼠子宫平滑肌β2受体表达的影响

表3 滇桂艾纳香提取物对DUB大鼠子宫平滑肌β2AR表达的影响

3.3 滇桂艾纳香提取物增加DUB大鼠子宫平滑肌Ca2+浓度及CREB磷酸化如表4所示,DUB模型组Ca2+浓度略高于空白对照组,但二者差异无统计学意义;与DUB模型组相比,滇桂艾纳香0.4 g·kg-1组子宫平滑肌Ca2+浓度增加(P<0.05),滇桂艾纳香0.2 g·kg-1组子宫平滑肌Ca2+浓度明显增加(P<0.01),表明滇桂艾纳香提取物可以增加DUB大鼠子宫平滑肌Ca2+浓度。

表4 滇桂艾纳香提取物对DUB大鼠子宫平滑肌Ca2+浓度的影响

如表5、图2所示,与空白对照组相比,正常妊娠组大鼠p-CREB蛋白表达上升(P<0.05);与DUB模型组相比,滇桂艾纳香0.2 g·kg-1组大鼠p-CREB蛋白表达上升(P<0.05)。滇桂艾纳香0.4 g·kg-1组大鼠p-CREB/CREB较空白对照组以及DUB模型组均上升(P<0.05),表明滇桂艾纳香提取物可以增加DUB大鼠CERB磷酸化水平。

图2 滇桂艾纳香提取物对DUB大鼠子宫平滑肌CREB活化水平的影响

表5 滇桂艾纳香提取物对DUB大鼠子宫平滑肌CREB活化水平的影响

4 讨论

DUB在中医学中归属于“崩漏”疾病范畴,即患者因脏腑受损、气血失调等无法制约经血,使经血非经期而下,逐渐变成崩漏[9]。滇桂艾纳香是传统的壮族民间用药,具有调经止血的功效,可用于治疗经期提前、产后血崩、妇女功能性子宫出血等症状,因其有疗效好且副作用小的特点,以滇桂艾纳香为主要原料制成的妇血康颗粒、伊血安颗粒等多种民族成药现已应用于临床。目前对于滇桂艾纳香的研究,大多还停留在化学成分及含量的研究上,药效物质基础及作用机制都尚未明晰。郑丹等[10-11]发现滇桂艾纳香的乙醇提取物中含有大量有机酸成分,这与本实验前期研究结果[6]相同。根据本实验结果并结合姜建萍等[12]的研究发现,认为滇桂艾纳香提取物中的有机酸成分可能是通过促进子宫收缩这一途径产生对DUB的治疗作用,这与Huang等[13]的报道相一致。

子宫收缩功能受损引发宫缩乏力是产后出血的主要原因[14],因此增强子宫收缩可有效控制由产后子宫收缩乏力所造成的出血。滇桂艾纳香可能是通过调节子宫平滑肌的收缩状态治疗DUB。如姜建萍等[12]发现,滇桂艾纳香提取物及其含药血清均可提高小鼠离体子宫和大鼠在体子宫的收缩能力。本研究发现,使用滇桂艾纳提取物治疗的DUB大鼠子宫收缩频率升高,表明该提取物能促进早孕流产不全大鼠子宫的收缩,与那裘雪等[15]报道的滇桂艾纳香近缘种植物白花九里明的有机酸提取物可显著兴奋小鼠离体子宫平滑肌的结果相吻合。

子宫收缩的分子机制包括细胞内钙浓度的变化、钙敏化机制的调节等。在子宫收缩过程中,Ca2+起到了非常重要的调控作用[16-17],如Kusaka等[18]发现在大鼠肌层细胞中,PKC可通过影响Ca2+离子浓度,调节子宫的收缩状态。目前临床上用于促进子宫收缩的药物缩宫素主要是通过刺激子宫释放大量的Ca2+,促使Ca2+迅速流到棘细胞中,使子宫收缩[19];米索前列醇在体内转化为米索前列醇酸后,通过提高子宫平滑肌细胞通透性和Ca2+浓度,从而增强子宫收缩力[20-21]。CREB是一种细胞核内调控因子,能被多种因子诱导磷酸化激活,如PKC、ERK、Ca2+浓度[22]、钙调蛋白激酶(CaM kinases,CaMKs)[23]等。由实验结果可知,滇桂艾纳香0.4 g·kg-1组Ca2+离子浓度增加,0.2 g·kg-1组Ca2+离子浓度明显增加,同时子宫p-CREB/CREB水平上升,这提示伴随着Ca2+浓度增加的CREB激活可能是滇桂艾纳香提取物调节子宫收缩的重要作用机制。

根据Phillips等[24]发现CREB在G蛋白的调节中起关键作用,并能显著影响子宫肌层的观点,本课题组前期基于网络药理学研究发现,滇桂艾纳香中的有机酸成分可能是通过影响调控子宫平滑肌β2受体及其下游相关信号通路产生治疗DUB的作用。β肾上腺素受体是一种跨膜的G蛋白偶联受体,通过活化胞内PKA实现细胞外的信号向细胞内传导激活[18],子宫平滑肌上的β2肾上腺素受体的激活能直接抑制子宫平滑肌的收缩。当β2受体活性被抑制时,PKA激酶活性也随之降低。本研究中滇桂艾纳香治疗的DUB大鼠子宫平滑肌PKA活力水平显著降低,同时子宫组织中β2AR蛋白表达水平无显著变化,可推断滇桂艾纳香提取物降低PKA活力的效果可能源于对降低β2肾上腺素受体的激活水平,从而促使子宫平滑肌收缩,产生治疗DUB的作用,这与韦玥吟等[6]滇桂艾纳香可能是通过阻断β肾上腺素受体从而影响子宫收缩的观点相一致。

综合上述,滇桂艾纳香提取物具有兴奋DUB大鼠子宫平滑肌的作用,其机制可能是通过抑制β2肾上腺素受体的活化,间接促进细胞内Ca2+增加和促进转录调节因子CREB的活化,从而可能增加子宫平滑肌中与收缩相关的转录调控,促使子宫肌层收缩以产生治疗DUB的作用。