基于代谢组学的两种罗布麻叶片类黄酮和酚酸成分分析

张庆，李国旗*，车金凤，赵长海

（1.宁夏大学 西北土地退化与生态恢复国家重点实验室培育基地，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学 西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；3.宁夏大学 生态环境学院，宁夏 银川 750021）

类黄酮和酚酸物质是广泛存在于植物中的次生代谢产物，在多种植物中发挥重要的作用。例如，类黄酮物质能够控制植物花色的形成［1］，提高植物抵御生物和非生物胁迫的能力等［2］。类黄酮和酚酸作为药用植物的主要活性成分，具有多种生物功能，对人体健康有益，如类黄酮等多酚具有抗氧化作用，可改善血管内皮功能、胰岛素分泌，有降血压作用［3］。大量实验数据证明了酚酸物质在心血管、癌症、糖尿病、炎症等疾病中的保护作用［4-5］。

罗布麻（Apocynum venetumL.）为多年生宿根草本植物［6］，于1997年被《中华人民共和国药典》收录，有清热利湿、平肝安神等功效［7］。罗布麻叶提取物中的主要活性成分为类黄酮物质，如芦丁、金丝桃苷、异槲皮素、槲皮素、山柰酚等［8-9］。类黄酮和酚酸物质含量在不同的罗布麻品种之间差异较大［10］，此外，类黄酮含量还受到生长环境和采收季节等外在因素的影响［11-12］。

LC-MS广泛靶向技术结合了非靶向和靶向代谢组学的优点，可定性、定量和高覆盖地检测植物中代谢物的含量［13］，已广泛应用于各种植物的次生代谢物研究，如铁皮石斛中黄酮代谢机理［14］，紫外线对大豆异黄酮含量的影响［15］，不同葡萄品种在成熟过程中黄酮类化合物的差异研究［16］。然而目前对罗布麻中类黄酮和酚酸2种物质的代谢组学研究较少，鉴于此，本文拟研究罗布麻和大麻状罗布麻（Apocynum cannabinumA. DC.）［17］中的类黄酮和酚酸代谢物的种类和相对含量，分析2种罗布麻之间的代谢物质差异，以揭示类黄酮和酚酸的合成途径，为罗布麻的药用资源开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品种植及采集

2021年4月于罗布麻试验田挖取繁殖根段，将根段每6个种植于长40 cm × 宽30 cm × 高40 cm花盆中，盆底部垫2层纱布，覆盖的土壤质地为林下土 ： 营养土（1 ： 1），定期浇水施肥除草松土。待植株长至30 ～ 40 cm，选取长势良好且高度一致的植株中下部成熟叶片混合，每种植物3个重复；置于10 mL冻存管中，并迅速放入液氮中冷冻，之后转至-80℃冰箱保存。

1.2 样品提取

将样品置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥，随后用研磨仪（MM 400，Retsch）研磨至粉末状；每种样品称取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每30 min将样品涡旋1次，每次持续30 s，共涡旋6次，之后将样品混合液置于4℃冰箱过夜；将样品离心后，吸取上清液，用微孔滤膜（孔径0.22 μm）过滤并保存于进样瓶中，用于UPLCMS/MS分析［18］。质控样本（Quality control samples， QC）制备参照吴宇等［19］的方法，将所有样品提取液混合成QC样本，用于分析样本在相同处理方法下的重复性。在仪器的分析过程中，QC样本间隔固定的试验样本共同进行质谱测序，以检测分析过程的重复性。

1.3 数据分析

基于迈维生物技术有限公司MWDB自建库和代谢物信息公共数据库，根据二级谱信息进行物质定性［20-21］。代谢物定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式分析完成。将过滤处理后获得的代谢物质数据提交到R上进行主成分分析（Principal components analysis， PCA）；根据正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLA-DA）模型分析代谢组数据。基于OPLA-DA结果，从获得的多变量分析OPLSDA模型的变量重要性投影筛选2个品种之间的差异代谢物，筛选标准：选取Fold Change ≥ 2和Fold Change ≤ 0.5且VIP ≥ 1的代谢物。将得到的相应差异代谢物提交到KEGG网站进行相关通路分析。

2 结果与分析

2.1 样品质控

对不同QC质谱检测分析的总离子流图（TIC图）进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。如图1所示，TIC图曲线重叠性高，质谱峰保留时间和强度一致，说明仪器稳定性较好，检测结果可靠。

图1 TIC重叠图Fig.1 TIC overlay diagram

将所获得的代谢物高分辨二级质谱数据与公共数据库进行比对，在罗布麻和大麻状罗布麻中共检测到194种酚酸物质和275种类黄酮物质。进一步将检出的类黄酮进行分类，包括黄酮醇、黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、花青素、黄酮碳糖苷、查耳酮、黄烷醇类、二氢异黄酮10类。

2.2 代谢物多元统计分析

对所有样本进行PCA分析，结果如图2所示。第一主成分值为56.43%，第二主成分值为14.80%；仅观察横坐标时，罗布麻样品均位于PC1负半轴，大麻状罗布麻样品均位于PC1正半轴。大麻状罗布麻样品3与大麻状罗布麻样品1、2间存在轻微的分散，而罗布麻的3个样品生物学重复间的差异较小。总体可见，2种罗布麻的代谢物能够得到区分，组间差异大于组内差异。PCA分析是一种无监督的分析方法，缺点是不能忽略组内误差。为排除与实验无关的某些因素引起的代谢变化，应用有监督的OPLS-DA模型进行进一步分析［21］。

图2 2种样品的PCA得分图Fig.2 PCA scores plot of two samples

对2种罗布麻的代谢物进行OPLS-DA分析，结果如图3所示。罗布麻和大麻状罗布麻样品主要分布置性区间的右侧和左侧，说明该模型能够对2种罗布麻样品进行有效区分。Q2代表模型的预测能力，Q2＞ 0.9表明模型具有很好的预测能力和可靠性。通过对2种罗布麻叶片代谢物进行OPLS-DA分析可得R2X= 0.582，R2Y= 0.991，Q2= 0.954，说明OPLS-DA模型效果相较于PCA更稳定可靠。

图3 2种样品的OPLS-DA得分图Fig.3 OPLS-DA scores plot of two samples

2.3 代谢物分析

2.3.1 类黄酮物质分析

在2种罗布麻中共检测到275种类黄酮物质，包括121种黄酮醇类、49种黄酮类、30种二氢黄酮类、16种二氢黄酮醇类、13种异黄酮类、13种花青素、12种黄酮碳糖苷、11种查耳酮、9种黄烷醇类和1种二氢异黄酮类物质。罗布麻和大麻状罗布麻的主要类黄酮代谢产物（每种罗布麻类黄酮物质含量前30）如表1 ～ 2所示。对2种罗布麻中类黄酮物质进行归一化处理，如图4A所示。罗布麻和大麻状罗布麻的类黄酮物质含量明显被区分为两类，说明类黄酮物质含量在2种罗布麻中有明显差异。

表1 罗布麻中的主要类黄酮物质Tab. 1 The main flavonoids in A. venetum

表2 大麻状罗布麻中的主要类黄酮物质Tab. 2 The main flavonoids in A. cannabinum

图4 代谢物聚类热图Fig.4 Cluster heat map of metabolites

2.3.2 酚酸物质分析

在罗布麻和大麻状罗布麻叶片中共检测到194种酚酸物质，主要的酚酸代谢产物（每种罗布麻酚酸物质含量前30）如表3 ～ 4所示。聚类热图可以直观的反应2种罗布麻间物质含量的差异，对检测到的所有酚酸物质进行聚类分析，如图4B所示，酚酸物质含量在2种罗布麻中有明显差异。

表3 罗布麻中的主要酚酸物质Tab. 3 The main phenolic acids in A. venetum

表4 大麻状罗布麻中的主要酚酸物质Tab. 4 The main phenolic acids in A. cannabinum

2.4 差异代谢物筛选分析

基于OPLS-DA结果，根据差异代谢物筛选标准，筛选出差异代谢物，共得到124种差异显著代谢物质，其中包括类黄酮80种，酚酸44种。在大麻状罗布麻中，51种类黄酮物质含量高于罗布麻，差异最大的为染料木素-8-C-葡萄糖苷；在罗布麻中，29种类黄酮物质含量高于大麻状罗布麻，差异最大的为黄柏环合苷。在大麻状罗布麻中，22种酚酸物质相对含量高于罗布麻，差异最大的为4-O-β-D-葡萄糖基-4-香豆酸；在罗布麻中，22种酚酸物质含量高于大麻状罗布麻，差异最大的为1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖。根据以上分析结果，我们认为染料木素-8-C-葡萄糖苷、黄柏环合苷、4-O-β-D-葡萄糖基-4-香豆酸和1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖可作为鉴别这2种罗布麻品种的关键物质。

2.5 代谢通路分析

利用KEGG数据库对2个品种罗布麻间的差异代谢物进行注释，并进行功能富集，结果如图5所示，富集分析共标注到10个代谢通路中，分别是泛醌和其他萜类奎宁的生物合成、酪氨酸代谢、芪类，二芳基庚烷和姜酚的生物合成、苯丙烷生物合成、代谢途径、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、次级代谢物生物合成、辅酶因子生物合成和花青素生物合成。这些差异代谢物参与一个或多个代谢途径，如：忍冬苷、白麻苷和槲皮苷等均参与了黄酮和黄酮醇生物合成；根皮苷查耳酮和黄颜木素等参与了类黄酮生物合成；芥子酰苹果酸和1-O-芥子酰-D-葡萄糖等参与了苯丙烷生物合成；龙胆酸和红景天苷等参与了酪氨酸代谢途径；反式-5-O-对香豆酰莽草酸和5-O-咖啡酰莽草酸参与了苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、芪类，二芳基庚烷和姜酚生物合成、代谢途径和次级代谢物生物合成；表儿茶素和花旗松素参与了类黄酮合成、代谢途径和次级代谢物生物合成。

图5 差异代谢物KEGG富集通路Fig.5 Enriched KEGG pathways of differentially expressed metabolites

对差异代谢物KEGG代谢途径进行注释，结果如图6所示，发现大部分代谢物富集到黄酮和黄酮醇生物合成、类黄酮生物合成和苯丙烷生物合成这3条途径中。大麻状罗布麻中的木犀草苷、白麻苷、芦丁、烟花苷、忍冬苷、槲皮素-3-O-桑布双糖苷、反式-5-O-对香豆酰莽草酸、5-O-咖啡酰莽草酸和对香豆醇含量均高于罗布麻，罗布麻中的根皮苷和黄颜木素含量高于大麻状罗布麻。类黄酮物质因具有抗氧化、清除自由基和抑菌等药用价值而受到广泛关注，一定程度上可认为这3条代谢途径对于罗布麻的药用价值具有重要意义，代谢通路中涉及到的差异代谢物可作为区分2种罗布麻药用成分差异的重要依据。

图6 差异代谢物的生物合成途径Fig.6 Biosynthetic pathways of differential metabolites

3 讨论

植物代谢组学具有覆盖范围广、灵敏度高和准确性高等特点，结合多元统计方法可揭示不同植物品种的代谢组分差异［23-24］。在本研究中，利用LCMS广泛靶向代谢组检测技术分析了2个罗布麻品种中的类黄酮和酚酸代谢物的种类和差异，共检测出275种类黄酮和194种酚酸物质。检测到的代谢物数量远远超过其它检测方法［25］，表明LC-MS代谢组测序技术更为灵敏，是鉴定药用植物活性成分的有力工具，为药用植物研究提供了新思路和新方法。

《中国药典》以槲皮素和山柰酚为对照品，金丝桃苷为测定指标，用薄层色谱法来鉴别供试品［7］。石秋梅等［26］通过比较罗布红麻和罗布白麻叶中的芦丁、金丝桃苷及异槲皮苷这3种类黄酮成分含量的差异，评价了这2种罗布麻的功效。而在本研究中，2种罗布麻的这3种物质含量无显著差异，用中国药典质量控制法来鉴别这2种罗布麻存在一定局限性。我们通过LC-MS检测发现染料木素-8-C-葡萄糖苷、黄柏环合苷、4-O-β-D-葡萄糖基-4-香豆酸和1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖的含量在2种罗布麻中差异显著，因此我们将这4种物质作为鉴别罗布麻和大麻状罗布麻的关键物质。

次级代谢物的积累不仅受环境因素的影响，如温度、光线、水和矿物质等，还受到基因型的影响，如物种、菌株和品种等［27-29］。本研究对2种罗布麻中差异显著的代谢物进行分析，发现大麻状罗布麻中有51种类黄酮和22种酚酸物质含量高于罗布麻，29种类黄酮和22种酚酸物质含量低于罗布麻。说明2种罗布麻在代谢成分上相似，但在含量上有一定区别，这与Chan等［30］发现罗布麻和白麻2个品种的黄酮类化合物化学成分和含量存在差异这一结果一致。类黄酮类化合物被认为是应对各种非生物胁迫的保护性物质，可以防止、抑制和清除活性氧的生成，减轻氧化损伤［31］。秦雯婷等［32］研究了不同耐旱性品种大豆在干旱胁迫下异黄酮含量的变化，发现耐旱品种中异黄酮含量高于敏感品种。本实验组前期研究发现，大麻状罗布麻较罗布麻抗旱能力更为突出［33］，推测这可能与类黄酮物质含量积累有关。

罗布麻叶的主要活性成分为类黄酮物质，在人机体中起着重要作用。罗布麻中山柰酚和槲皮素等具有显著的抗抑郁活性［34］；金丝桃苷、芦丁和槲皮素的巫山神茶可以预防小鼠食道癌［35］；含有芦丁、金丝桃苷、异槲皮素、杨梅素、槲皮素和山柰酚的罗布麻干叶提取物有心脏保护作用［36］。在大麻状罗布麻中检测到金丝桃苷、山柰酚、芦丁、槲皮素和异槲皮素的含量与罗布麻无显著差异，说明大麻状罗布麻中的药用成分含量与罗布麻相似，有作为药用植物的可能。本研究中，2种罗布麻类黄酮和酚酸物质基本相似，可能具有相似的生物活性。后续可进行药理实验，挖掘大麻状罗布麻的药用价值及进一步开发利用罗布麻的药用资源。