响应面法优化黄芩茎叶黄酮类成分提取工艺及其含量测定

2024-02-26闫杰张思访毛贤贤许晨新刘贝

湖北农业科学 2024年1期

闫杰张思访毛贤贤许晨新刘贝

摘要：采用单因素和响应面试验考察乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度对黄芩茎叶中黄酮成分提取量的影响；在此基础上，采用HPLC法测定了17个黄芩茎叶中黄酮成分的含量。结果表明，黄芩茎叶中黄酮成分的最佳提取工艺为乙醇浓度55%、料液比1∶50、提取时间60 min、提取温度50 ℃，应用最佳提取工艺黄酮成分提取量为24.43 mg/g；不同产地黄芩茎叶中黄酮成分的含量存在差异，含量范围为15.839～26.044 mg/g。响应面法优化黄芩茎叶中黄酮成分的提取工艺稳定、准确可靠，所建立的黄酮成分含量测定方法稳定可靠，可为黄芩茎叶的质量评价及深度开发研究提供参考。

关键词：黄芩茎叶；黄酮类成分；提取工艺；高效液相色谱法（HPLC）；含量测定；响应面法

中图分类号：R284.2 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）01-0131-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.01.024 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of extraction process of flavonoids from Scutellaria baicalensis stem and leaf by response surface methodology and its content determination

YAN Jie， ZHANG Si-fang， MAO Xian-xian， XU Chen-xin， LIU Bei

（School of Pharmacy， Jiangsu Health Vocational College，Nanjing 211800， China）

Abstract： The effects of ethanol concentration， solid-liquid ratio， extraction time and extraction temperature on the extraction of flavonoids from Scutellaria baicalensis stem and leaf were investigated by single factor and response surface experiment. On this basis， the contents of flavonoids in 17 Scutellaria baicalensis stems and leaves were determined by HPLC. The results showed that the optimum extraction condition of flavonoids in Scutellaria baicalensis stem and leaves was ethanol concentration of 55%， solid-liquid ratio of 1∶50， extraction time of 60 min and extraction temperature of 50 ℃. Under the optimal extraction process，the extraction amount of flavonoids was 24.43 mg/g. The contents of total flavonoids in Scutellaria baicalensis stem and leaf from different regions were different， ranging from 15.839 mg/g to 26.044 mg/g. The response surface methodology was stable， accurate and reliable to optimize the extraction process of total flavonoids from Scutellaria baicalensis stem and leaf. The established method for the determination of flavonoids content was stable and reliable， which could provide a reference for the quality evaluation and further development of Scutellaria baicalensis stem and leaf.

Key words： Scutellaria baicalensis stem and leaf； flavonoids； extraction process； high-performance liquid chromatography （HPLC）； content determination；response surface methodology

收稿日期：2022-04-18

基金項目：江苏卫生健康职业学院校级课题（JKC202001）；江苏省大学生创新创业训练计划项目（202114255005Y）

作者简介：闫杰（1991-），女，山东鱼台人，助理实验师，主要从事中药鉴定及天然药物化学研究，（电话）13913983874（电子信箱）

125270191@qq.com；通信作者，张思访（1978-），男，河南鹿邑人，实验师，硕士，主要从事天然药物提取分离与鉴定研究，（电话）13913004686（电子信箱）weidazhang@126.com。

黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，其性味苦、寒；归肺、胆、脾、大肠、小肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效［1］。已有研究报道，黄芩中含有黄酮类、木脂素、氨基酸类和挥发油等化学成分［2，3］，其中的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素等黄酮类成分是主要活性物质，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、解热镇痛、降血压和降血脂等药理作用［4-7］。据统计，黄芩作为中国大宗药材之一，与其配伍的复方制剂近百余种，因此黄芩的市场需求量逐年递增。目前，黄芩的产地主要集中在黑龙江、内蒙古、甘肃和陕西等地。

临床上常以黄芩的根作为药用部位，而对其地上部分研究较少［8，9］。随着传统中药资源的深度开发利用，黄芩茎叶已成为研究热点。有研究表明，黄芩茎叶具有抗衰老、改善记忆障碍等作用［10，11］，因此对黄芩茎叶的质量及其功效物质的研究将有利于扩大黄芩非传统药用部位的应用价值。目前，黄芩中黄酮类成分的提取方法有回流提取法、微波法和超声波辅助提取法等［12-15］。对其提取工艺的研究多采用正交试验设计法和响应面法，而对其工艺的评价仅以黄芩苷或野黄芩苷为评价指标具有一定局限性。因此，以黄芩茎叶中多种黄酮成分作为提取工艺的评价指标具有一定参考价值。

响应面法是一种基于合理的试验设计得到试验数据，并通过分析各因素和试验指标的回归方程得出最优工艺参数的统计方法，该方法设计简单、预测结果可靠，已广泛应用于中药有效成分的提取［16-18］。关于黄芩茎叶黄酮类成分提取工艺的研究鲜有报道［19-21］。本研究基于高效液相色谱法（HPLC），以黄芩茎叶黄酮成分提取量为指标，采用响应面法优化黄芩茎叶黄酮成分提取工艺，并对不同产地黄芩茎叶中黄酮类成分的含量进行测定，以期为黄芩茎叶中黄酮类成分的提取工艺和质量评价提供参考。

1 材料與方法

1.1 材料与试剂

17批黄芩茎叶样品均购于药材市场，经本实验室鉴定为黄芩地上茎叶部位，其来源信息见表1。野黄芩苷（批号RP200515，纯度≥99.31%）、黄芩苷（批号RP201015，纯度≥99.41%）、野黄芩素（批号RP200624，纯度≥99.19%）、汉黄芩苷（批号RP210215，纯度≥99.85%）、芹菜素（批号RP200606，纯度≥99.13%）、黄芩素（批号RP190604，纯度≥98.52%）、汉黄芩素（批号RP200729，纯度≥99.99%）、白杨素（批号RP210522，纯度≥99.91%）对照品均购于成都麦德生科技有限公司。乙腈：色谱纯，德国Merck公司；乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲酸：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；0.22 μm微孔滤膜：天津市领航实验设备股份有限公司；水为实验室自制超纯水。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260 Infinity型高效液相色谱仪：配有G1311C型四元梯度泵、G1329B型自动进样器、G1316A型柱温箱、G4212B型DAD检测器及ChemStation工作站，美国Agilent公司；ME104E型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Heraeus Fresco 21型高速冷冻离心机，Thermo Fisher 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；KH5200B型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；默克Milli-Q实验室纯水仪，德国Milli-Q达姆施塔特默克集团。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验设置不同乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、 1∶50）、提取时间（30、60、90、120、150 min）和提取温度（30、40、50、60、70 ℃），以黄酮成分的提取量为指标，考察乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度对黄芩茎叶黄酮类成分提取量的影响。

1.3.2 响应面试验设计在单因素试验基础上，采用Design Expert 8.0软件基于Box-Behnken试验原理设计，设定乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4个因素，并采用四因素三水平的响应面分析法优化黄芩茎叶黄酮成分的提取工艺参数，以黄酮成分的提取量为评价指标，确定最佳提取工艺。试验因素与水平见表2。

1.3.3 HPLC法测定黄芩茎叶黄酮成分含量

1）色谱条件。色谱柱：Agilent ZOBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）体系，梯度洗脱：0～10 min，10%～15%B； 10～20 min，15%～18%B；20～30 min，18%～22%B；30～60 min，22%～45%B；60～65 min，45%～60%B；65～75 min，60%～10%B；检测波长276 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量5 μL。

2）对照品溶液的制备。精密称取各对照品适量，加甲醇配置成野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素和白杨素质量浓度分别为0.15、0.12、0.15、0.11、0.11、0.11、0.09、0.10 mg/mL的对照品储备液，即得混合对照品母液。

3）供试品溶液的制备。精密称取黄芩茎叶粉末（S1黑龙江）0.50 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，在一定温度条件下，按照一定的料液比加入一定浓度的乙醇溶液，超声提取一段时间，冷却后将上清液定容至50 mL容量瓶，经13 000 r/min离心后用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度各因素对黄芩茎叶黄酮成分提取量的影响如图1所示。由图1a可知，随着乙醇浓度的增加，黄芩茎叶黄酮成分的提取量先增加后降低，50%乙醇浓度条件下黄酮成分提取量最高，推测乙醇浓度高于50%时，黄芩茎叶中非黄酮类的弱极性物质溶出，使得黄酮提取量降低；由图1b可知，当溶剂体积增加时，黄酮提取量增加，料液比为1∶40时黄酮成分提取量最大，溶剂体积继续增大时，黄酮提取量降低，可能是其中非黄酮类物质溶出量增加，使得黄酮提取量减少；由图1c可知，随着提取时间的变化，黄芩茎叶黄酮成分提取量变化较小，提取60 min时提取率达到最高，说明超声提取可以满足黄芩茎叶中黄酮成分的提取且提取时间适宜；由图1d可知，随着提取温度的变化，黄酮成分提取量先升高后降低，40 ℃时达到最大值。综合上述各因素，确定响应面的各因素水平分别为乙醇浓度（40%、50%、60%）、料液比（1∶30、 1∶40、1∶50）、提取时间（30、60、90 min）和提取温度（30、40、50 ℃）。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面设计与试验结果基于单因素试验结果，以乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）为变量，以黄芩茎叶黄酮成分的提取量为评价指标，采用Box-Behnken试验设计4因素3水平试验，如表3所示。

2.2.2 回归方程与方差分析采用Design Expert 8.0软件对表3数据进行拟合，得到回归方程为：Y=23.62+0.58A+1.36B+0.20C+1.07D+0.42AB+0.36AC+1.66AD-0.64BC+0.56BD+0.27CD-1.83A2-0.72B2-1.19C2-0.60D2。

回归方程方差分析结果见表4。由方差结果可知，模型F=5.84，P<0.01，表明该模型具有极显著意义；失拟项P>0.05，没有显著差异，表明该模型拟合程度良好；B、D、AD、A2、C2的P均小于0.01，表明其对黄酮成分的提取量有显著影响。通过对各因素的F比较分析可知，各因素对黄芩茎叶黄酮成分提取量的影响为料液比>提取温度>乙醇浓度>提取时间。

在响应面图中，因素对响应面的交互影响越显著，响应面的坡度越陡峭，反之交互作用影响越小，则响应面的坡度越趋于平缓，各因素交互作用对黄酮成分提取量的影响结果如图2所示。由图2可知，乙醇浓度和提取温度（图2c）两者交互作用显著，表现为响应面陡峭，其余因素之间交互作用较小，表现为响应面走势平缓。通过响应面分析优化，得到最佳提取工艺参数为乙醇浓度57.47%、料液比1∶49.28、提取时间59.77 min、提取溫度49.31 ℃，此条件下预测的黄酮成分提取量为26.08 mg/g。考虑到实际操作，调整乙醇浓度55%、料液比1∶50、提取时间60 min、提取温度50 ℃。在此条件下进行3次重复试验，得到黄芩茎叶黄酮成分提取量为24.43 mg/g，误差为6.3%，说明该试验结果与模型拟合较好。

2.3 HPLC法测定黄芩茎叶黄酮成分含量结果分析

2.3.1 方法学考察

1）系统适应性。分别取混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂，按“1.3.3”项下色谱条件进行分析，色谱图见图3。各组分分离度均大于1.5，空白溶剂对测定无干扰，表明该方法的系统适应性和专属性良好。

2）线性关系考察及定量限、检测限测定。取“1.3.3”项下对照品储备液稀释成系列混合对照品溶液，按“1.3.3”项下色谱条件进样分析，以各对照品的质量浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。以信噪比S/N=3和S/N=10，分别计算检出限（LOD，Limit of detection）和定量限（LOQ，Limit of quantitation），结果见表5。结果显示各成分线性关系良好，灵敏度高。

3）精密度试验。精密吸取同一对照品溶液，按“1.3.3”项下色谱条件连续进样6次分析，测得各成分峰面积的相对标准偏差（RSD，Relative standard deviation）在0.91%～0.97%，结果表明仪器精密度良好。

4）重复性试验。精密称取同一批次样品（S1），平行制备6份供试品溶液，按“1.3.3”项下色谱条件进样分析，测定各成分峰面积的RSD在0.21%～4.35%，表明重复性良好。

5）稳定性试验。精密称取黄芩茎叶样品（S1黑龙江）制备供试品溶液，按“1.3.3”项下色谱条件，在0、4、8、16、24、48、72 h进样分析，测定各成分峰面积的RSD在0.42%～3.76%，表明供试品溶液在72 h内稳定。

6）加样回收率试验。精密称取已知含量的黄芩茎叶粉末样品，平行制备6份供试品溶液，精密吸取400 μL供试品溶液，分别精密加入对照品母液100 μL，按“1.3.3”项下色谱条件进样分析，记录各成分的峰面积，计算加样回收率。结果显示各成分加样回收率均值在96.35%～104.93%，RSD在0.15%～3.53%，表明回收率良好。

2.3.2 样品含量测定分别取17批黄芩茎叶粉末制备供试品溶液，按“1.3.3”项下色谱条件进样分析，计算出各样品中黄酮类成分的含量，结果见表6。由表6可知，不同产地黄芩茎叶中黄酮成分含量存在一定差异，其中野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素和白杨素含量分别为11.890～20.420 mg/g、0.169～0.393 mg/g、0.370～7.148 mg/g、0.031～1.535 mg/g、0.274～1.136 mg/g、0.104～0.359 mg/g、0.005～0.083 mg/g、0.006～1.021 mg/g。17批黄芩茎叶中，黄酮成分含量前三的分别是野黄芩苷平均含量为16.217 mg/g、野黄芩素平均含量为2.527 mg/g、芹菜素平均含量为0.543 mg/g；汉黄芩素平均含量最低，仅为0.025 mg/g。此外，由产地划分可知，黑龙江产黄芩茎叶黄酮成分平均含量为19.964 mg/g；内蒙古产黄芩茎叶黄酮成分平均含量为20.913 mg/g；山西产黄芩茎叶黄酮成分平均含量为19.979 mg/g，3个产地黄芩茎叶黄酮成分含量差异较小。

3 结论与讨论

本研究通过单因素试验，考察了乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度对黄芩茎叶黄酮类成分提取量的影响，采用响应面法优化了提取工艺参数为乙醇浓度55%、料液比1∶50、提取时间60 min、提取温度50 ℃，并通过工艺验证其提取工艺准确可靠；采用HPLC法建立了黄芩茎叶中黄酮成分的含量测定方法，结果显示不同产地黄芩茎叶黄酮类成分含量具有一定差异，从成分种类来看，野黄芩苷是黄芩茎叶中主要成分物质，因而其平均含量最高；从产地划分来看，黑龙江、内蒙古和山西产地黄芩茎叶中黄酮成分平均含量相差不大，说明从上述黄酮成分来看这3个产地的黄芩茎叶较为相似。本研究建立的方法灵敏度高、分离效果好、结果稳定可靠，可为黄芩茎叶的质量评价及资源开发利用提供参考依据。

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