基于网络药理学和分子对接技术探讨杏贝止咳颗粒治疗感染后咳嗽的作用机制Δ

王 清,马浩然,喻强强,孙 朋,余建玮,叶 超#

(1.江西中医药大学研究生院,南昌 330006; 2.江西中医药大学附属医院肺病科,南昌 330006)

感染后咳嗽(postinfectious cough,PIC)是指上呼吸道感染的急性期出现喷嚏、鼻塞和流涕等症状缓解或消失后,咳嗽持续3～8周,可出现刺激性干咳或咳少量白色黏液痰等,相关辅助检查无明显异常[1]。临床上以病毒性感染导致的感冒咳嗽最为常见[1]。一项互联网调查结果显示,在过去3个月内患有感冒和咳嗽的患者中,有81%的患者出现咳嗽症状,69%的患者表示咳嗽持续时间比其他感染症状更长[2]。PIC是自限性疾病,可以自行缓解,对于有明显咳嗽症状的患者,一般会采取相应的药物治疗,常用镇咳药、抗组胺药和减充血剂等[1]。但常疗效不佳,不良反应较大,且病情反复,无法完全控制,严重影响了患者的日常生活。杏贝止咳颗粒源自国医大师周仲瑛教授经验方,根据《太平惠民和剂局方》三拗汤+《金匮要略》甘桔汤为基础加减组方而成[3],有麻黄、苦杏仁、浙贝母、桔梗、前胡、百部、北沙参、木蝴蝶和甘草,共9味药材,作用为清宣肺气、止咳化痰[4]。但是其活性成分及其在PIC治疗中的主要作用机制尚不明确,因此,本研究运用网络药理学方法与分子对接技术进行分析,为探讨其作用机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 杏贝止咳颗粒活性成分筛选及其预测潜在靶点

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https://tcmsp-e.com/)检索杏贝止咳颗粒中麻黄、苦杏仁、浙贝母、桔梗、前胡、百部、北沙参、木蝴蝶和甘草等9味药材的活性成分及其预测潜在相关靶点。其中活性成分筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18,药物半衰期≥4 h[5]。甘草由于成分多,为便于计算统计,增加氢键供体数(Hdon)<5、脂水分配系数(AlogP)<5、氢键受体数(Hacc)<5和肠代谢吸收程度(Caco-2)≥-0.40等参数,预测靶点来自DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)。最后,将靶点数据导入Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中进行规范基因靶点名称。为方便研究,其活性成分展示为药材名大写首字母及2个数字,共同成分展示为1个大写字母及数字。

1.2 PIC相关靶点收集

利用人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM,https://omim.org/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、Pharm GKB数据库(https://www.pharmgkb.org/)和DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/),以“postinfectious cough”为关键词进行检索,获得PIC疾病相关靶点。

1.3 杏贝止咳颗粒与PIC共有靶点获取

将杏贝止咳颗粒活性成分潜在作用靶点与PIC相关靶点利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)取交集,获取共有靶点。

1.4 构建杏贝止咳颗粒活性成分-靶点-PIC疾病网络图

将杏贝止咳颗粒活性成分、中药名称、PIC疾病及预测的基因靶点制作成Excel表格,利用Cytoscape 3.8.2软件,建立杏贝止咳颗粒活性成分-靶点-PIC疾病网络图,并使用“Network analyzer”功能计算该网络的Degree值,筛选出杏贝止咳颗粒治疗PIC重要活性成分。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络

将杏贝止咳颗粒治疗PIC共有靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/)中,设置物种为人类,置信度为0.04,隐藏游离的节点,得到杏贝止咳颗粒治疗PIC的PPI网络图。将此网络以TSV格式文件导出,再将其导入Cytoscape 3.8.2软件中进一步分析。

1.6 杏贝止咳颗粒治疗PIC共有靶点基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

通过Metascape数据库(https://metascape.org/)对杏贝止咳颗粒治疗PIC的55个共有靶点进行GO和KEGG富集分析,并利用Cytoscope 3.8.2软件构建通路-靶点网络图。

1.7 杏贝止咳颗粒重要活性成分与PIC核心靶点分子对接

以杏贝止咳颗粒活性成分-靶点-PIC疾病网络图中的重要活性成分作为配体分子,通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载其2D结构并保存为 SDF格式,使用Chem3D 20.0进行MM2 Minimize能量最小优化为3D结构的MOL2格式。从PPI网络图中选取前6个核心靶点作为受体蛋白,分别从PDB数据库保存并下载其3D结构的PDB格式文件,导入PyMOL 2.5.2软件对受体蛋白进行去水、去配体处理。最后利用AutoDockTools 1.5.6、AutoDock 4.2.6进行分子对接,将结果依次导入OpenBabelGUI转化文件格式、PyMOL 2.5.2可视化处理。

2 结果

2.1 杏贝止咳颗粒活性成分及其潜在作用靶点

利用TCMSP数据库共筛选得到杏贝止咳颗粒活性成分96个,其中麻黄17个,苦杏仁11个,浙贝母3个,桔梗4个,前胡10个,百部16个,北沙参3个,木蝴蝶16个,甘草16个;潜在作用靶点共1 982个,剔除重复值后有272个。

2.2 PIC疾病靶点

分别从OMIM数据库、GeneCards数据库、Pharm GKB数据库和DrugBank数据库检索得到相关靶点基因19、113、17和112个,共261个靶点,剔除重复值后有212个。

2.3 杏贝止咳颗粒与PIC共有靶点

利用Venny 2.1.0取交集,获得杏贝止咳颗粒活性成分与PIC共有靶点55个。

2.4 杏贝止咳颗粒活性成分-靶点-PIC疾病网络图

筛选出杏贝止咳颗粒共82个活性成分对应55个共同作用靶点,利用Cytoscape 3.8.2软件,建立杏贝止咳颗粒活性成分-靶点-PIC疾病网络图,见图1。图1中共有132个节点,742条边,其中活性成分用正六边形表示,基因为菱形,中药名称为圆形,疾病为三角形,其Degree值越大,说明节点越大,其成分越重要。该网络中重要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇。

2.5 PPI网络图

利用Cytoscape 3.8.2软件中的CytoNCA插件,根据介数中心性(BC)对网络进行分析,得到PPI网络图,见图2。其BC值越高,表明相关靶点越重要,影响力越大,相互作用可能性越强。其中BC值排序靠前的靶点有5-羟色胺转运体基因(SLC6A4)、白细胞介素(IL)6、肾上腺素能受体β2(ADRB2)、糖皮质激素受体(NR3C1)、原癌基因(JUN)和前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)。

图2 PPI网络图

2.6 G0功能富集和KEGG通路分析

2.6.1 GO功能富集分析:利用Metascape数据库,对55个共有靶点进行GO功能富集分析,共获得877个生物过程(BP)、44个细胞组分(CC)和103个分子功能(MF)。根据基因数目进行排序,筛选出BP、CC和MF各前10条,并使用微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制GO功能富集BP、CC和MF三合一柱状图,见图3。由图3可见,BP主要包括对各种刺激的反应、细胞对有机氮化合物的反应、系统进程的调节、离子的调节、细胞增殖的负调节、细胞对有机环状化合物的反应、血液循环、循环系统流程和细胞活化等;CC包括突触膜、突触后膜、膜筏、膜微区、突触前膜、突触前膜的构成和突触后膜的构成等;MF包括G蛋白偶联胺受体活性、细胞因子活性、受体配体活性、信号受体调节活性、细胞因子受体结合、氧化还原酶活性、蛋白质同源二聚化活性、神经递质受体活性和突触后神经递质受体活性等。

2.6.2 KEGG通路分析:利用Metascape数据库对55个共有靶点进行KEGG通路分析,共获得112条通路。根据基因数目进行排序,筛选前20条通路,通过微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)对KEGG进行分析,见图4。将通路和对应的基因靶点利用Cytoscope 3.8.2软件,建立通路-靶点网络图,见图5。由图5可知,神经活性配体-受体相互作用信号通路、癌症信号通路、钙离子信号通路及糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体(RAGE)信号通路涉及的相关靶点基因较多。

图4 共同靶点KEGG通路分析

图5 通路-靶点网络图

2.7 分子对接

选取重要活性成分槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇与核心靶点SLC6A4、IL-6、ADRB2、NR3C1、JUN和PTGS2进行分子对接。结果显示,活性成分与核心靶点的结合能均在-18.16～-36.36 kJ/mol范围内,结合能越低,对接效果越好,活性成分配体分子与核心靶点受体蛋白之间的结合越稳定,亲和力越高,见表1、图6。

表1 杏贝止咳颗粒重要活性成分与核心靶点的分子对接情况

3 讨论

PIC为亚急性咳嗽,目前已有研究发现,其发病机制与神经因素、炎症因子、气道内皮黏膜损伤、气道高反应和炎症介质的释放密切相关[6],而神经递质、炎症细胞、炎症介质及免疫球蛋白在炎症反应中发挥着重要作用[7]。中医认为,PIC病位在肺,系风邪袭肺,肺气失宣所致,治宜疏风宣肺、利咽止咳[1]。杏贝止咳颗粒是由三拗汤+甘桔汤加减组方而成,其组方为麻黄、苦杏仁、浙贝母、桔梗、前胡、百部、北沙参、木蝴蝶和甘草。其中麻黄和苦杏仁为君药,麻黄入肺经,宣肺气,开皮毛,降上逆之气,善止咳平喘[8];苦杏仁辛散苦降,肃降肺气而能止咳平喘[9]。浙贝母、桔梗和前胡为臣药,浙贝母苦寒辛散,开泄通降,故能清热化痰止咳[10];桔梗味苦而辛,苦泻辛散,宜宣肺气,善止咳[11];前胡降气祛痰,宣散风热,临床可用于肺气降之不下之喘咳[12]。百部、北沙参和木蝴蝶为佐药,百部入肺经,善润肺降气止咳,临床用于新久咳嗽、肺痨咳嗽、百日咳等[13];北沙参镇咳祛痰,主治肺热燥咳、阴虚咳嗽等症[14];木蝴蝶清肺热,润肺止咳、利咽开音[15]。甘草为使药,具有润肺化痰止咳、调和诸药的作用[16]。杏贝止咳颗粒中诸药合用,具有良好的治疗PIC的功效。本研究通过网络药理学方法和分子对接技术,对杏贝止咳颗粒治疗PIC的作用机制进行探讨。

分析可知,槲皮素、β-谷甾醇以及豆甾醇是杏贝止咳颗粒的重要活性成分。槲皮素是黄酮类化合物,具有降低气道炎症反应的作用,通过抑制炎症介质IL-1、IL-6和IL-10的分泌释放,达到抗炎效果[17-18]。β-谷甾醇能抑制炎症介质释放、抑制核因子κB(NF-κB)通路的激活[19]。β-谷甾醇的抗炎、抗氧化作用与细胞中IL-6的表达有关。β-谷甾醇可通过阻断Toll样受体4/NF-κB、炎症小体传感器蛋白和信号转导及转录激活因子等相关炎症信号通路的转导,从而降低炎症介质的释放与表达[20]。豆甾醇具有显著的抗炎效果,其作用机制是通过抑制环氧合酶-2以及诱导型一氧化氮合酶等蛋白质的表达,从而降低前列腺素E2、一氧化氮的释放[21]。SLC6A4、IL-6、ADRB2、NR3C1、JUN和PTGS2是治疗PIC的核心靶点。有关研究表明,IL-6是重要的炎症因子,其可以通过调节炎症细胞的增殖和分化,从而参与调节呼吸道炎症反应[22]。ADRB2可介导去甲肾上腺素诱导相关细胞产生和释放IL-10,调节炎症反应[23]。ADRB2在肺组织、支气管平滑肌和支气管内皮细胞中也起到调节肺功能的作用[24]。PTGS2具有抗炎、抗氧化的功能,在炎症病理过程中发挥着巨大作用,能抑制炎症反应[25-26]。根据KEGG通路分析,杏贝止咳颗粒治疗PIC可能与神经活性配体-受体相互作用通路、癌症通路、钙离子信号通路及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等相关,其核心靶点均分布在这些通路上。相关研究报告,咳嗽有关的受体分布于气道上皮细胞与感觉神经上的离子通道之间,当病原体侵入时,其感觉神经上的离子通道开放,在感染过程中,C纤维会促进神经递质的分泌与释放[27-28]。神经活性-配体受体相互作用通路是质膜上所有与细胞内信号通路相关的受体和配体集合,其能调节神经内分泌和免疫系统,从而对PIC起到治疗作用[29]。钙离子信号通路在细胞分裂、生长、死亡过程中有着重要作用,在钙离子的刺激下,可以通过一系列信号通路激活对应的受体,从而调控细胞增殖、侵袭、转移和凋亡。AGE-RAGE信号通路能通过激活丝裂原激活的蛋白激酶、NF-κB等信号通路,促进炎症介质的表达和释放,进而诱导慢性细胞激活及相关组织损伤。AGE-RAGE还可诱导激活各种细胞间的信号级联,促进氧化应激和一系列炎症反应[30]。

综上所述,杏贝止咳颗粒具有多成分、多靶点、多通路防治PIC的特点,同时也反映了中医的整体观。本研究为深入探讨杏贝止咳颗粒的作用机制和临床应用提供了理论基础。