优化T-SPOT.TB在区分脊柱结核与其他脊柱感染中的诊断效能

周 莹,胡小江,江仲景,陈俊宝,张 广,张宏其,李艳冰,高琪乐

(1. 广西医学科学院广西壮族自治区人民医院精准联合检验中心,广西 南宁 530021; 2. 中南大学湘雅医院骨科脊柱外科,湖南 长沙 410008; 3. 中南大学湘雅医院检验科,湖南 长沙 410008; 4. 中南大学湘雅医院国家老年疾病临床医学研究中心,湖南 长沙 410008)

结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌引起的一种传染性疾病。根据世界卫生组织(WHO)报道,2018年全球大多数新发TB患者来自东南亚地区(44%),中国TB发病率位居世界第三(9%)[1]。在所有TB中,肺外结核病(EPTB)约占10%,其中半数累及肌肉骨骼系统,脊柱是最常见的受累部位(占1%～2%)[2]。早期抗结核治疗可降低脊柱结核(STB)肢体残疾和损伤发生率,但目前缺乏早期诊断STB的手段。确诊TB需要通过有创性检查取得病灶标本,但受病灶部位取材不易、取材不充分及标本中菌量有限等因素影响,TB病原学和病理学检测阳性率低[3],诊断难度大。结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)是利用结核分枝杆菌特异的早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)刺激外周血中的免疫细胞,通过酶联免疫斑点技术(ELIS POT)检测产生干扰素-γ(IFN-γ)的单个T淋巴细胞数量。T-SPOT.TB是一项全世界广泛认可的TB快速诊断技术,在TB诊断中具有较高的灵敏度和特异度[4],但应用于STB诊断的研究报道甚少。

脊柱感染的致病因素可以是化脓性细菌(如葡萄球菌属或布鲁氏菌)感染、寄生虫感染或结核分枝杆菌感染[5]。STB与非结核脊柱感染的影像学表现及临床特征相似,缺乏特异性的鉴别诊断方法,使得临床医生制定诊疗策略时流程复杂。目前针对TB诊断方法的研究多数是比较TB患者和健康个体之间的结果,而比较TB和其他感染个体之间的研究仍较少,可提供临床鉴别诊断的经验不足。临床中,脊柱感染的原因多种多样,有效区分STB和非结核脊柱感染尤为重要。目前,针对T-SPOT.TB在鉴别STB和非结核脊柱感染能力方面的数据极其有限,鲜有报道分析T-SPOT.TB在非结核脊柱感染中的阳性情况。因此,本研究统计T-SPOT.TB在STB与非结核脊柱感染中的灵敏度和特异度,分析T-SPOT.TB在STB与非结核脊柱感染鉴别诊断中的诊断效率,评价优化后的T-SPOT.TB指标的诊断效能。

1 资料与方法

1.1 资料来源 收集2010年1月—2019年5月某院收治住院的脊柱感染患者临床特征、临床症状和血清学检测结果等数据。本研究取得该院伦理委员会批准,所有入选研究对象及其家属均被告知,且签署书面知情同意书。

1.2 纳入标准 (1)术中脊柱受累病灶区可获得组织标本用于病理学和病原学检查,后者进行细菌培养或病原菌聚合酶链反应(PCR)检测;(2)病理学检查提示脊柱感染;(3)无严重的基础疾病或人类免疫缺陷病毒感染;(4)至少维持3个月随访。

1.2.1 STB组纳入标准 根据2021年WHO TB指南,本研究中诊断STB的标准为:(1)结核分枝杆菌培养阳性;(2)Xpert阳性;(3)TB高发地区的患者符合相应的组织学检查特征(至少包含干酪性坏死、肉芽肿性炎、抗酸染色阳性三个特点之一)且抗结核治疗有效;(4)第二代基因检测技术在患者病灶标本中检出结核分枝杆菌基因。

1.2.2 非STB组纳入标准 (1)组织标本病原菌培养或PCR检测结果提示除结核分枝杆菌外的其他病原菌感染;(2)病理学检查提示化脓性炎症;(3)肺部CT未见结核征象,痰结核分枝杆菌培养阴性。

1.3 T-SPOT.TB检测 试剂盒购自英国Oxford Immunotec公司,严格按照试剂盒的标准操作程序进行操作。采集肝素抗凝外周血5 mL,分离外周血单个核细胞(PBMCs),洗涤后对细胞计数,制备成浓度为2.5×105/mL的PBMCs细胞悬液;将ESAT-6、CFP-10及100 μL的2.5×105/mL的PBMCs置入培养板抗体反应孔内,37℃、5%CO2温箱培养18 h。次日洗涤培养板后置入二抗,孵育1 h,洗涤培养板,底物置入后采用显色液孵育5 min,蒸馏水终止反应,记录斑点形成细胞数。每个斑点表示1个效应T淋巴细胞,从而计算出抗原特异度细胞的频率。(1)T-SPOT.TB 结果应包含阳性对照情况,阴性对照情况,A孔(ESAT-6)结果(A孔斑点数-阴性对照孔斑点数),B孔(CFP-10)结果(B孔斑点数-阴性对照孔斑点数)。(2)阳性:若阴性对照孔斑点数为0～5个,测试孔(ESAT-6或CFP-10)斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6个;或者当阴性对照孔斑点数≥6个,测试孔斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数。(3)阴性:如果上述标准不符合且阳性对照孔正常。(4)结果不确定:如果阴性对照孔斑点数>10个或阳性对照孔斑点数<20个。当结果不确定时,抽取血标本重新检测。

1.4 统计分析 所有统计分析和作图均应用R4.3.0软件,分类变量采用计数(百分比)进行统计描述,组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法;连续变量采用QQ图和直方图判断正态性后,均为非正态分布变量,使用中位数(25百分位,75百分位)[M(P25,P75)]进行描述,组间比较采用Wilcoxon秩和检验。单因素logistic回归通过“rms”包实现,并提取每个变量单因素logistic回归的OR值、P值和95%置信区间(CI)。混淆矩阵通过“caret”包绘制并计算灵敏度、特异度、阴性预测值、阳性预测值、阴性似然比、阳性似然比和准确度及95%CI。相关性热图通过“corrmorant”包和“ggplot2”包进行可视化。受试者工作特征(ROC)曲线通过“pROC”包计算并通过“ggplot2”包进行绘制。

2 结果

2.1 患者特征 共纳入132例脊柱感染患者,其中78例确诊为STB(STB组),54例诊断为非结核脊柱感染(非STB组)。STB组与非STB组患者年龄、性别、病变节段、白细胞计数(WBC)、C反应蛋白(CRP)及结核抗体两组间比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。非STB组患者降钙素原(PCT)阳性率(31.48% VS 10.26%,P=0.005)、红细胞沉降率(ESR)值均高于STB组[88.5(57, 115.5)mm/h VS 60.5(38.25, 90.25)mm/h,P=0.010]。STB组与非STB组患者ESAT6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6的特异性斑点数量两组间比较,差异均具有统计学意义(均P<0.01)。见表1。

2.2 研究指标诊断STB的logistic回归分析 单因素二分类logistic回归分析结果显示,T-SPOT.TB检测在STB与非结核脊柱感染的鉴别诊断中具有较高的预测价值(OR=4.188,95%CI:1.847～9.974,P<0.001),PCT、CRP、ESR可能是鉴别诊断STB的指标(均P<0.05);性别、年龄、WBC、结核抗体及病变节段在两者鉴别诊断中预测价值均不明显(均P>0.05)。见表2。此外,ESAT-6、CFP-10以及CFP-10+ESAT-6的特异性点数在单因素logistic回归中均具有统计学差异(均P<0.001),这三个指标对于鉴别诊断STB具有潜在应用前景。

表2 研究指标诊断STB的单因素二元logistic回归分析

2.3 T-SPOT.TB在STB和非STB鉴别诊断的性能优化 ESAT-6、CFP-10及ESAT-6+CFP-10在STB和非STB组的表达量分布见图1(a、b、c),图1d展示了T-SPOT.TB 用于诊断STB与非STB的混淆矩阵。相关性统计结果显示,ESAT-6与CFP-10具有较好的相关性(r=0.74,见图1e)。通过绘制ROC曲线,确定ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6在STB和非STB鉴别诊断中的最佳截断值,分别为12.5、19.5、36见图2(a、b、c),各自的混淆矩阵见图2(d、e、f),在STB中的AUC分别是0.765 6、0.741 5、0.778 6,均具有较好的诊断性能,其中以CFP-10+ESAT-6的AUC最高。

注:a为ESAT-6在STB和非STB的特异性斑点数量分布;b为CFP-10在STB和非STB的特异性斑点数量分布;c为ESAT-6+CFP-10在STB和非STB的特异性斑点数量分布;d为T-SPOT.TB用于诊断STB与非STB的混淆矩阵;e为纳入研究STB患者各研究指标之间的相关性热图。

注:a为ESAT-6在STB诊断中的ROC曲线;b为CFP-10在STB诊断中的ROC曲线;c为ESAT-6+CFP-10在STB诊断中的ROC曲线;d为最佳截断值下ESAT-6用于诊断STB与非STB的混淆矩阵;e为最佳截断值下CFP-10用于诊断STB与非STB的混淆矩阵;f为ESAT-6+CFP-10的最佳截断值用于诊断STB与非STB的混淆矩阵。

2.4 T-SPOT.TB检测及最佳截断值的诊断效能 T-SPOT.TB检测在鉴别STB与非STB中的灵敏度为67.68%(95%CI:57.43%～76.53%),特异度为66.67%(95%CI:48.10%～81.45%),T-SPOT.TB阳性预测值为85.90%(95%CI:75.74%～92.41%),阴性预测值为40.74%(95%CI:27.86%～54.94%),阳性似然比为2.030(95%CI:1.230～3.352),阴性似然比为0.485(95%CI:0.354～0.664),准确度为67.42%。T-SPOT.TB检测ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6最佳截断值的诊断效能见表3。

表3 T-SPOT.TB最佳截断值的ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6的诊断效能

3 讨论

既往关于肺结核的发病机制、诊断和治疗的研究很多,而EPTB至今仍处于相对被忽视的状态[6]。很少有研究集中于脊柱感染的诊断,包括但不限于TB、布鲁氏菌病、常见细菌感染(如葡萄球菌属)的化脓性脊柱炎等。骨和关节结核如治疗不当,将导致肢体畸形、活动受限,甚至截瘫[7]。正确的药物选择(抗结核或抗菌药物)对患者的治疗效果至关重要。本研究根据细菌培养或病原菌基因检测结果,将132例脊柱感染分为STB组和非STB组。在脊柱感染诊断中,比较T-SPOT.TB检测与传统的血清学试验(如WBC、ESR、CRP、PCT和TB抗体等)结果,在脊柱感染的鉴别诊断中,ESR、CRP、PCT和TB抗体的特异度不佳;而T-SPOT.TB检测在脊柱感染的鉴别诊断中,其诊断效果具有统计学意义(P<0.01)。

本研究中,T-SPOT.TB检测的灵敏度为67.68%(95%CI:57.43%～76.53%),特异度为66.67%(95%CI:48.10%～81.45%)。灵敏度低于以往的报道,但特异度一致[8-13],可能是本研究执行了严格的纳入和排除标准,同时一些诊断不明确的STB被排除,使得灵敏度相对降低。

研究[14]报道,重新评估T-SPOT.TB检测的截断值可能有助于其在肺结核或EPTB鉴别诊断中的作用。本研究分析T-SPOT.TB检测的斑点数量分类,STB组与非STB组患者的ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6的特异性斑点数量比较,差异均具有统计意义(均P<0.001);在单因素logistic回归分析中,ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6均具有较高的预测价值(均OR>1,P<0.001),且当CFP-10+ESAT-6的斑点数超过36这个截断值时,在鉴别STB与非结核脊柱感染中具有较强的诊断效能。

作为在致病性结核分枝杆菌中广泛存在的蛋白,ESAT-6广泛应用于TB的诊断;CFP-10常被IFN-γ识别,具有较强的特异性。本研究中,优化后的ESAT-6、CFP-10分别用于STB及非STB的诊断,其灵敏度及准确度均高于T-SPOT.TB,诊断效能有所提升。同时,在研究中对CFP-10联合ESAT-6进行了优化诊断效能分析,灵敏度(67.68%～83.82%)和准确度(67.42%～75.56%)明显提高,但特异度的提高却不明显(62.32%～67.19%)。特异度水平较低可能是由于脊柱感染中存在少数非结核分枝杆菌,如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、转黄分枝杆菌和胃分枝杆菌,T-SPOT.TB不能区分以上几种非结核分枝杆菌感染所致。

临床实践中,T-SPOT.TB作为一种常用的TB诊断方法,在STB诊断中的应用价值仍有待提高。本研究中,优化后的T-SPOT.TB诊断性能明显提高,对STB与非STB的诊断有重要意义,具有一定的临床应用价值。

T-SPOT.TB和Xpert MTB/RIF检测具有较高的灵敏度和特异度。T-SPOT.TB检测诊断活动性结核的灵敏度为75.3%～93.6%,特异度为63.4%～85.2%[8-14]。Tang等[7]对Xpert MTB/RIF的研究表明,Xpert MTB/RIF试验在诊断STB方面的灵敏度为70.9%,特异度为100%。Xpert MTB/RIF检测和T-SPOT.TB检测是WHO认可的可用于肺部和肺外TB的诊断方法[1, 15]。在国内,T-SPOT.TB检测比Xpert MTB/RIF检测成本更低、更普及[16],因此T-SPOT.TB检测更具良好的临床运用前景,且T-SPOT.TB作为TB早期诊断的工具,仅需外周血即可完成检验,成本较低,能够广泛筛选疾病发生情况。

本研究探讨了T-SPOT.TB检测在STB鉴别诊断中的应用。尽管研究结果显示T-SPOT.TB在区分STB与非STB方面表现出相对较高的诊断效能,但也存在一些局限性,这些局限性需要在进一步研究中予以克服和深入探讨。(1)本研究的样本规模相对较小,仅包括132例患者。可能导致结果的偏差和不稳定性,因此需要更大规模的研究来验证本研究的发现。(2)本研究采用回顾性研究设计,存在无法控制患者的选择及信息完整性的问题,可能存在信息偏差的风险。(3)本研究仅关注了T-SPOT.TB在STB鉴别诊断中的性能,没有涵盖其他可能影响结果的因素,如临床症状、影像学表现等。未来的研究可考虑将T-SPOT.TB与其他诊断方法进行比较,以更全面地评估其在STB诊断中的价值。(4)本研究仅考虑了特定地理区域的患者,可能存在地域性差异及结果外推受限。(5)虽然本研究发现,CFP-10+ESAT-6特异性斑点数对于STB的诊断性能更佳,但仍需要更多的研究来确认其作为诊断STB的可靠性。因此,需要进一步的前瞻性研究来验证本研究结论,以便更全面地了解T-SPOT.TB在STB鉴别诊断中的潜在局限性和优势。

本研究表明,T-SPOT.TB检测在区分STB和非STB中具有较高的诊断效能。在脊柱感染患者中T-SPOT.TB阳性,特别是当CFP-10+ESAT-6的斑点数超过36时,诊断为STB的可能性大。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。