清肠解毒汤对溃疡性结肠炎相关癌变的治疗作用及PI3K/Akt/mTOR通路调控机制

李 华，张 敏，周 华，方佩斐

（安徽医学高等专科学校，安徽合肥 230601）

溃疡性结肠炎相关癌变10年发病率约2%，20年发病率约8%，30年则达18%[1]。近年来，UC发病率逐年升高，导致溃疡性结肠炎相关癌变发生率随之增加[2]。溃疡性结肠炎相关癌变属中医“大肠泄”、“滞下”等范畴，发病机理为湿热蕴结而致气滞血瘀，夹糟粕积滞于大肠，引起本病[3]。清肠解毒汤源自俞根初《重订通俗伤寒论》，该汤剂以“气血并治”为原则，通过清热燥湿、活血解毒治疗疾病，临床中关于其辅助治疗晚期大肠癌已有报道[4]，但关于其对溃疡性结肠炎相关癌变的作用及具体调控机制尚不明确。为此，本研究通过观察清肠解毒汤对溃疡性结肠炎相关癌变的影响，并初步探讨其调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，50只，5周龄，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2018-0001。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器 葡聚糖硫酸钠（DSS，MP Biomedicals公司，纯度99%、相对分子质量50000Da）、氧化偶氮甲烷（AOM，Sigma公司），便隐血检测试纸（万华普曼生物工程有限公司），逆转录试剂盒（日本Takara公司），BCA蛋白定量分析试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗大鼠磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）单抗、蛋白激酶B（Akt）单抗、p-Akt多抗、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）单抗（一抗）、山羊抗兔PI3K、Akt、p-Akt、mTOR（二抗，美国Invitrogen公司），RM2255切片机（徕卡显微系统贸易公司），E200显微镜（Nikon仪器上海有限公司），Image Pro-Plus图像分析系统（美国Media Cybernetics图像技术公司）。

1.2 方法

1.2.1 中药清肠解毒汤 按照清肠解毒汤组方（焦山栀10 g，金银花炭、黄芩、连翘、赤芍各7 g，黄连、黄柏、大黄、枳壳、防风各3 g）取中药材，常规方法煎药，纱布过滤收集滤液，将滤液浓缩至含生药1.8 g/mL备用，用前蒸馏水稀释至0.9 g/mL、0.45 g/mL。

1.2.2 模型建立及样本收集 取50只SPF级大鼠，按照体重进行编码并随机分为5组，各10只，模型组、低、中、高剂量组采用AOM/DSS法建立溃疡性结肠炎相关癌变模型[5]；对照组饮用水不变，生理盐水替换DMH，继续饲养20周；低、中、高剂量组分别按照10 mL/kg灌胃浓度为0.45、0.9、0.18 g/mL的清肠解毒汤，保证灌胃剂量为4.5、9、1.8 g/kg，模型组和对照组灌胃10 mL/kg生理盐水，每天灌胃1次，持续8周，灌胃期间所有大鼠自由饮水和摄食。

1.2.3 疾病活动指数评分（disease activity index，DAI） 灌胃1 d、4周、8周分别根据大鼠大便性状、体质量下降率、粪便隐血试验结果评估DAI；0分：大便正常、体质量下降率≤1%、隐血试验隐血；1分：软便、1%＜体质量下降≤5%、隐血试验阴性；2分：软便、5%＜体质量下降≤10%、隐血试验阳性；3分：腹泻、10%＜体质量下降≤15%、隐血试验阳性；4分：腹泻、体质量下降＞15%、隐血试验阳性、肉眼血便。

1.2.4 不典型增生/癌变数计数及组织病理学检测 末次灌胃后2 h处死大鼠，立即解剖取自回盲结合部至肛门上1 cm的整段大肠，垂直剖开，观察是否有瘤体，并计数大肠前段、中段和后段不典型增生/癌变数，不典型增生按照Riddell等标准[6]描述为低度和高度不典型增生；取瘤体组织，对照组取同位置健康组织，4%多聚甲醛固定，常规制作厚度为4 μm的连续石蜡切片，并采用苏木精-伊红染色法（HE）进行染色，中性树胶封片后在显微镜下观察结直肠黏膜病变。

1.2.5 PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量检测 末次灌胃后2 h处死大鼠，立即解剖取新鲜大肠组织，Trizol法提取总核糖核酸（RNA），逆转录获得互补链脱氧核糖核酸（cDNA），经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR），严格按照试剂盒说明书设定反应体系，设定反应条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性30 s，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，重复42个循环，72 ℃延伸5 min。以β-actin作为内参对照物，所有实验重复3次取平均值，2-△△CT为目的基因PI3K、AKT、mTOR的相对表达强度。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.6 PI3K、AKT、pAKT、mTOR蛋白相对表达量 采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，电转仪转膜60 min，封闭液摇床封闭2 h（常温），洗涤后加入稀释一抗（1:800），摇床孵育过夜（4 ℃），洗涤后，加入稀释二抗（1:5000），常温孵育2 h，暗室中曝光，扫描拍照，采用BandScan工具进行灰度值分析，以目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值比值描述蛋白相对表达量。

1.3 观察指标

（1）大鼠一般情况观察及不同时刻DAI评分对比；（2）不典型增生/癌变数对比；（3）组织病理学观察；（4）PI3K、AKT、mTOR mRNA表达情况对比；（5）PI3K、mTOR蛋白表达及AKT/pAKT对比。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察及不同时刻DAI评分对比

对照组大鼠精神状态、进食均正常，模型组精神萎靡、毛发粗糙无光泽，血便、腹泻，体重减轻，3剂量组给药后精神状态逐渐好转，血便减轻，其中高剂量组好转最为明显。模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组DAI评分组间、时间、交互比较（P＜0.05），见表2。

表2 不同时刻DAI评分对比（，分，n=10）

表2 不同时刻DAI评分对比（，分，n=10）

与模型组比，aP＜0.05；与低剂量组比，bP＜0.05；与中剂量组比，cP＜0.05；与干预1 d比，dP＜0.05；与干预4周比，eP＜0.05

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2.2 不典型增生/癌变数对比

对照组大鼠无溃疡性结肠炎相关癌变；其余4组结肠前段、中段及后段不典型增生/癌变数组间比较（P＜0.05），见表3。

表3 不典型增生/癌变数对比（，个，n=10）

表3 不典型增生/癌变数对比（，个，n=10）

与模型组比，aP＜0.05；与低剂量组比，bP＜0.05；与中剂量组比，cP＜0.05

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2.3 组织病理学观察

组织病理学观察发现，对照组结肠黏膜上皮完整、形态正常，模型组结肠黏膜上皮细胞脱落，部分可见低度不典型增生、癌变，固有腺体萎缩，伴有大量炎性细胞浸润，3剂量组上述病理变化均有所减轻，见图1。

图1 各组结肠黏膜HE染色（×100）

2.4 PI3K、AKT、mTOR mRNA表达情况对比

AKT mRNA相对表达量组间比较（P＞0.05），PI3K、mTOR mRNA相对表达量组间比较（P＜0.05），见表4。

表4 PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量对比（，n=10）

表4 PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量对比（，n=10）

与对照组比，aP＜0.05；与模型组比，bP＜0.05；与低剂量组比，cP＜0.05；与中剂量组比，dP＜0.05

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2.5 PI3K、mTOR蛋白表达及AKT/pAKT对比

PI3K、mTOR蛋白相对表达量及AKT/pAKT组间比较（P＜0.05），见图2、表5。

图2 Western blot检测PI3K、AKT、pAKT、mTOR蛋白表达

表5 PI3K、mTOR蛋白表达及AKT/pAKT对比（，n=10）

表5 PI3K、mTOR蛋白表达及AKT/pAKT对比（，n=10）

与对照组比，aP＜0.05；与模型组bP＜0.05；与低剂量组比，cP＜0.05；与中剂量组比，dP＜0.05

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3 讨论

溃疡性结肠炎相关癌变发病机制复杂，涉及基因突变、多基因调控、环境改变等多种复杂过程[7]。研究证实[8]，PI3K/Akt/mTOR信号通路参与多种肿瘤的发生、发展过程的调控，包括肿瘤细胞癌变、增殖、代谢等。研究表明[9]，在炎症状态下，PI3K/Akt/mTOR信号通路处于过度激活状态，推测在溃疡性结肠炎相关癌变过程中发挥重要作用。清热解毒汤在抗炎、抗肿瘤方面均有重要作用[10]。

本研究发现，模型组大鼠精神状态及结直肠黏膜病变最为明显，经不同剂量清肠解毒汤干预后精神状态好转，结直肠黏膜病变减轻。随时间的延长、剂量的增加大鼠DAI评分不同程度改善，随剂量的增加结肠前、中及后段不典型增生/癌变数减少，提示清肠解毒汤具有治疗溃疡性结肠炎相关癌变的作用，其中1.8 g/kg清肠解毒汤效果最佳。清肠解毒汤方剂由9味常用中药材组成，焦山栀泻火利湿、凉血止痛；金银花炭活血化瘀、补虚疗风；黄芩除湿止泻；连翘清热散结、消肿止痛；赤芍凉血散瘀、通经止痛；黄连、黄柏清热燥湿、泻火解毒；大黄泻下攻坚、凉血逐瘀；枳壳破气行痰、消积止痛；防风祛风劫镖、防风止痉，全方配伍通过祛除湿邪毒、排除淤血，同时调理肺腑之气，将活血、清热、燥湿三法合一，发挥清肠解毒之功。现代药理学研究证实，焦山栀（栀子）、连翘具有抗菌消炎作用[11]；金银花、黄芩多糖具有调节机体免疫力作用[12]；枳壳对胃肠道平滑肌具有双向调节作用[13]。

此外，5组PI3K、mTOR蛋白表达及AKT/pAKT差异显著，对照组最低，模型组最高，3剂量组介于二者之间，提示清肠解毒汤可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路达到治疗溃疡性结肠炎相关癌变的目的。PI3K/AKT/mTOR通路在多种癌细胞中均处于激活状态，在促进癌细胞的增殖、分化等过程中发挥关键作用。PI3K属于异源二聚体，AKT使其下游重要效应分子，当PI3K接受胞外信号刺激后，信号转至AKT分子使之发生膜转位，继而被磷酸化激活进入胞内[14]。mTOR是调控细胞分裂、代谢的重要靶点基因，相关信号信息可通过PI3K及下游AKT传递至mTOR启动靶点TOR复合体1（TORC1），继而激活mTOR，参与细胞分裂、增殖等过程[15]。不同剂量清肠解毒汤灌胃溃疡性结肠炎相关癌变大鼠后，结直肠组织中PI3K基因和蛋白表达及AKT磷酸化被抑制，细胞分裂、代谢关键调控蛋白mTOR表达被抑制，达到治疗溃疡性结肠炎相关癌变的目的。

综上所述，清肠解毒汤可通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路发挥治疗溃疡性结肠炎相关癌变的作用，其中1.8 g/kg清肠解毒汤治疗效果最佳。