LASP-1在进展期腺瘤及癌变过程中诊断价值和分子机制研究

付娟娟，李思锦，周龙妹，李骏杰，李 萍，何培元，侯志平*

（1.承德医学院基础医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院；3.承德医学院中医学院）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]，具有高转移潜能，文献报道在CRC转移患者人群中，大部分原发肿瘤在小于0.01cm时就已经发生了远处转移[2]，而出现转移的患者五年生存率仅为12%[3]。因此，探索CRC发生的分子机制，寻找高敏感性肿瘤标志物，降低其死亡率是目前迫切需要解决的问题。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作为临床较常用的肿瘤标志物，常用于CRC疾病的监测指标[4]。LIM And SH3 Protein 1（LASP-1）蛋白属于LIM蛋白亚家族成员,也是肌动蛋白结合蛋白家族的成员之一，具有细胞信号转导及转录调控等作用[5]。在本研究中，我们通过检测CRC、结直肠腺瘤（colorectal adenomas，CRA)患者血浆中LASP-1、CEA的表达水平，探讨其临床诊断价值，并进一步通过免疫组化与生物信息学技术检测P53与LASP-1的表达情况，探讨可能导致癌变的分子机制。

图1 CRC、CRA和Normal组中血浆中LASP-1、CEA的表达情况

图2 LASP-1和CEA及联合模型诊断CRC、CRA的ROC曲线

图3 LASP-1在TCGA、GEO数据库中的表达水平

图4 LASP-1、P53在结直肠腺癌组织中表达情况

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2020年2月～2021年11月在承德医学院附属医院胃肠外科、消化内科就诊的48例CRC患者、13例CRA患者的外周血。48例CRC患者：男性21例，女性27例；年龄＞60岁22例，年龄≤60岁26例。13例CRA患者：男性8例，女性5例；年龄＞60岁10例，年龄≤60岁3例。所有患者均为未经放化疗的初诊患者，排除患有自身免疫性疾病、心血管疾病、严重肝肾疾病、血液病和感染性疾病的患者，并经过临床病理明确诊断，分期采用国际抗癌联盟腺癌TNM分期系统。另外收集22例Normal组外周血，男性8例，女性14例；年龄＞60岁19例，年龄≤60岁3例。入组人员均证实无肿瘤病史或严重系统性疾病。所有参与者均对本研究知情同意，并且本研究已经过承德医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 血浆样本收集

用EDTA采血管收集待检者外周血3 mL，4 ℃ 1900g离心10 min，小心吸取上清液至离心管中，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 ELISA法检测血浆样本LASP-1的含量

采用双抗体夹心ELISA法（上海语纯生物科技有限公司）检测血浆LASP-1含量。严格按照试剂盒说明书操作，酶标仪检测各孔样本吸光度值，Excel绘制标准曲线，计算各样品中LASP-1的浓度。

1.4 全自动化化学发光免疫分析法检测血浆CEA的表达情况

应用全自动化化学发光免疫分析法（瑞士罗氏公司）检测血浆CEA表达水平，严格按照说明书操作，仪器规格型号为瑞士罗氏公司生产的cobas 8000 e801全自动化学发光仪。CEA≥5 ng/mL为阳性。

1.5 免疫组化法检测结直肠腺癌组织中P53的表达情况

新鲜手术切除标本经10%福尔马林固定48 h，常规进行石蜡包埋切片，切片约4 μm厚。免疫组化法检测组织P53表达情况。选用P53的典型阳性病例作为阳性对照，阴性对照以PBS缓冲液替代一抗。采用半定量法，显微镜下观察检测结果。诊断标准：＜5%为阴性，5%～25%为弱阳性，26%～50%为阳性，≥51%强阳性。

1.6 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件，血浆中LASP-1与CEA表达水平的总体水平为正态分布，故计量资料以平均值±标准差表示，组间均数比较采用t检验及单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆中LASP-1、CEA的表达情况

CRC、CRA和Normal组患者血浆中LASP-1的表达水平分别是（113.11±30.05）、(110.03±28.47)、(26.05±19.00)pg/mL，CRC、CRA组患者血浆中LASP-1的表达水平均明显高于Normal组，差异有统计学意义（P＜0.001，图1A）；CRC组与CRA组之间无统计学差异（P=0.9309）。CRC、CRA和Normal组患者血浆中CEA的表达水平分别为（17.74±46.79）、(3.58±4.02）、（2.07±1.39）ng/mL，CRC、CRA和Normal组患者CEA表达水平无统计学差异（图1B）。

2.2 血浆中LASP-1、CEA的诊断效能评价

通过绘制ROC曲线并计算曲线下面积（area under the curve，AUC），分析其LASP-1和CEA表达水平及其诊断价值。CRC组血浆LASP-1表达水平的AUC值为0.9049，敏感性和特异性分别为0.8182、0.9796，临界值为40.78；血浆CEA水平的AUC值为0.7487，敏感性和特异性分别为0.9167、0.5，临界值为3.550，二者联合检测的AUC值为0.982（图2A）。CRA患者血浆LASP-1的AUC值为0.9580，敏感性和特异性分别为0.863、0.9231，临界值为45.96；血浆CEA的AUC值为0.5438，特异性和敏感性分别为0.75、0.5，临界值为2.465，二者联合的AUC为0.99（图2B）。

2.3 血浆中LASP-1、CEA的表达水平与CRC患者临床病理特征之间的关系

相关性分析结果显示，血浆中LASP-1的表达水平与年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期等无明显相关性（P均＞0.05，表2）。

表2 血浆中 LASP-1、CEA表达与CRC临床病理特征的相关性

2.4 LASP-1在TCGA、GEO数据库中的表达情况

TCGA数据库结果显示LASP-1在CRC组中的表达水平明显高于Normal组（P＜0.05,图3A），GEO数据库结果显示LASP-1在CRC组中的表达明显高于CRA组（P＜0.05,图3B）。

2.5 LASP-1、P53在结直肠腺癌组织中表达情况

免疫组化结果显示P53的阳性表达（图4A）呈棕黄/棕褐色细颗粒，以细胞核为主,阴性则无表达（图4B）。48例CRC组织中P53阳性表达31例，阳性表达率64.5%，高于平均突变率（48.4%）[6]。基于人类蛋白免疫组化表达数据库中（https://www.proteinatlas.org）比较了CRC与Normal组患者组织中LASP-1的表达情况，结果显示LASP-1的阳性表达呈棕黄/棕褐色细颗粒，分布在细胞质与细胞膜上，LASP-1在CRC组织中呈高表达（图4C），在Normal组呈低表达（图4D）。

3 讨论

根据2020年版中国腺癌诊疗规范[7]，对于疑似结直肠恶性肿瘤的患者需进行常规筛查，包括粪便隐血试验、血清肿瘤标记物、结肠镜等相关筛选检查。其中，结肠镜是诊断金标准，但结肠镜在早期诊断的应用率并不高，这可能与有创检查、价格昂贵、肠道准备复杂、患者依从性差有关[8]。如今CEA是认可度较高的血清检测指标，但近几年研究[9]发现，CEA在胃肠道恶性肿瘤、乳腺恶性肿瘤及其他恶性肿瘤的血清中都有不同程度的升高，其特异性不强，灵敏性不高，对肿瘤早期诊断作用不明显，只能作为诊断参考。因此，寻找新的CRC诊断的血清标志物具有重要意义。

LASP-1蛋白属于LIM蛋白亚家族成员，定位于人17号染色体q12-q21，该基因可编码一种肌动蛋白结合蛋白[10]。前期通过TCGA数据库分析得到LASP-1在CRC组织中的表达水平明显高于Normal组（P＜0.05），提示可能成为CRC诊断指标。LASP-1属于分泌性蛋白，可被分泌至血浆发挥作用。在本研究中，我们采用了ELISA法检测发现在CRC、CRA患者中血浆LASP-1是远高于Normal组，而CEA在3组样本中的表达却无明显差异，同时LASP-1诊断CRC、CRA的敏感性与特异性也均高于CEA。此外，与CEA相比，CRC、CRA患者中血浆LASP-1的AUC值更高，提示LASP-1有望成为诊断CRA、CRC的新的诊断标志物；检测血浆中LASP-1与CEA的联合诊断效能，结果显示联合检测可得到更高的AUC值。因此，血浆LASP-1与CEA联合检测在CRC早期诊断中有更好的临床应用价值。

结直肠腺癌的发生是一个复杂而有序的过程，从正常上皮到异常增生、腺瘤、癌变及癌的转移的过程中，通过一系列基因的突变、错配、癌基因的活化及抑癌基因的失活，形成了经典的“腺瘤-癌变”学说（图5）。P53基因是从大肠腺瘤到腺癌的分子标志物之一，目前已证实在正常肠上皮及轻度不典型增生腺瘤中，P53常无明显表达，随着疾病的进展，逐渐出现P53阳性表达，到腺瘤癌变及大肠癌早期阶段表达最高[14-16]。有研究[17]发现抑癌因子P53可在转录水平抑制LASP-1的表达。本研究中免疫组化结果显示CRC患者组织中P53阳性表达率65.9%，在癌组织呈高表达，人类蛋白免疫组化数据库中分析得到LASP-1在CRC癌组织中表达水平高于正常肠上皮组织中，提示LASP-1可能与P53及其他抑癌基因一样，也是肿瘤发生的原因。

图5 结肠癌发生发展的分子模式图

然而，本研究中也存在一些局限性。本研究样本例数较少，尚需要在大队列中进行更多的临床病例研究，以验证血浆LASP-1对腺癌患者的诊断效率。其次，本研究未得出LASP-1与临床病例特征的相关性，这可能与样本量少及未纳入IV期患者有关。因此，为了能够将LASP-1作为腺癌早期诊断的可靠指标，仍需要对其进行多中心大样本的临床与基础研究，以确立LASP-1对腺癌的诊断效率。