雄激素受体、Ki-67在三阴性乳腺癌中的表达以及与预后的关系

王维斯，国士刚，李国明，付新澳，李居尚，范宗奇

（1.承德医学院研究生学院，河北承德 067000；2.朝阳市中心医院；3.中国医科大学朝阳市中心医院）

乳腺癌（breast cancer，BC）是目前女性最常见的恶性肿瘤[1]，据国际癌症研究机构报告显示，2020年全球癌症患者的总人数增加约1900万，其中新增的乳腺癌人数约为226万，占比11.7 %[2]。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一种特殊亚型，其特点是患者的雌激素受体（estrogen receptor，ER）为阴性表达、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)为阴性表达[3,4]，目前TNBC还未找到特定的治疗靶点，缺乏有效治疗手段，患者无法从靶向治疗中受益[5]。雄激素受体（androgen receptor，AR）是一种类固醇受体，不仅与生殖密切相关，还在维持人体激素平衡中有重大作用。Ki-67是一种核蛋白，在细胞处于静止期时不表达，可用来提示细胞的增殖分化程度。本研究通过分析AR、Ki-67在TNBC中的表达情况，结合患者临床资料分析其临床意义，探究其与TNBC患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取朝阳市中心医院2015年1月～2020年5月诊治的TNBC女性患者88例作为观察组，同时纳入了NTNBC女性患者89例作为对照组。纳入标准：（1）在我院进行手术治疗，且通过病理诊断确诊；（2）术前未进行新辅助治疗；（3）完整的石蜡组织块和临床资料。排除标准：（1）乳腺癌手术史；（2）合并其他系统恶性肿瘤者；（3）乳腺癌复发。观察组年龄17～83岁，平均年龄（54.64±11.67）岁；体重指数(BMI)16.30～34.48，平均BMI（24.45±3.70）。对照组年龄29～81岁，平均年龄（55.35±10.35）岁；体重指数(BMI)17.58～37.22，平均BMI（25.78±3.80）。2组资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究符合医学伦理会审核标准。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 提取乳腺癌组织的石蜡标本，切片厚度为5μm。进行常规脱蜡和水化处理，随后进行相应的抗原修复。在免疫组化实验中使用SP法检测AR和Ki-67的表达。在实验实际操作中，严格按照说明书进行SP法检测。在阴性对照中，使用磷酸盐缓冲液替代一抗，采用已知抗体阳性标本作为阳性对照。

1.2.2 判定标准 细胞核内出现呈浅黄、棕黄的细小颗粒视为阳性细胞，当AR阳性细胞数量占所有肿瘤细胞数量比例≥1%时，则判定为阳性。Ki-67阳性标志是细胞核内出现棕黄色颗粒，Ki-67指数临界值为≤30%时定义为低表达，＞30%时定义为高表达[6]。

1.2.3 随访 患者出院后，通过电话随访和门诊复查随访，随访结局事件为患者死亡或截止值2023年5月，随访内容为患者的总生存时间（overall survival，OS）。OS定义为患者从术后第1天起至死亡日期或末次随访时间。

1.3 统计学处理

采用SPSS 26.0和R3.6.3软件进行统计分析。计数资料用（n,%）表示，组间差异比较采用χ2检验或 Fisher 精确概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AR、Ki-67在TNBC及NTNBC中的表达

AR在TNBC中阳性表达为棕黄色，在细胞核中表达（图1A），Ki-67在TNBC中阳性表达为棕褐色，在细胞核中表达（图1B）。

图1 AR、Ki-67在癌组织中的不同表达情况（SP×400）

AR在NTNBC中的表达较显著（图2A），在TNBC中的表达较弱（图2B），Ki-67在TNBC中的表达显著（图3A），在NTNBC中的表达较弱（图3B）。

图2 AR在不同组织中的表达情况（SP×100）

图3 Ki-67在不同组织中的表达情况（SP×100）

结果显示，AR在NTNBC组织中表达率高于TNBC中的表达率，Ki-67在TNBC中表达率高于NTNBC组织。差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 AR、Ki-67的表达与TNBC临床特征之间的关系

在TNBC组织中，AR的表达情况与淋巴结转移个数相关(P=0.033)。Ki-67的表达情况与肿瘤直径相关（P=0.027)，与淋巴结转移个数也相关（P=0.042），见表1。

表1 AR、Ki-67的表达与TNBC临床特征之间的关系

2.3 AR与Ki-67与预后之间的关系

AR阳性表达组和AR阴性表达组中，患者3年总生存率分别为89.21%和57.63%。Kaplan-Meier生存分析显示：AR阳性表达组和阴性表达组的3年总生存率相比，差异有统计学意义，见图4A。Ki-67高表达组和Ki-67低表达组的3年总生存率分别为57.38%和81.48%。Kaplan-Meier生存分析显示：Ki-67高表达组与Ki-67低表达组3年总生存率相比，差异有统计学意义，见图4B。

图4 Kaplan-Meier生存分析曲线图

2.4 AR与Ki-67相关性分析

在本研究88例TNBC中，有14例患者AR呈阳性表达、Ki-67高，47例表现为AR阴性表达、Ki-67高表达，12例表现为AR呈阴性表达、Ki-67低表达，15例表现AR阳性表达，Ki-67低表达。AR与Ki-67在TNBC中的表达呈负相关性关系（r=-0.320，P＜0.05），见表2。

表2 AR与Ki-67相关性分析

2.5 生存分析及列线图的构建

采用COX单因素回归分析方法，分析结果显示,肿瘤直径、病理分级以及AR、Ki-67的表达情况是乳腺癌预后的影响因素(P＜0.05)。淋巴结转移个数在实际临床应用中对患者的预后有意义，因此也纳入COX多因素回归分析的指标，结果显示,病理分级，淋巴结转移个数、AR、Ki-67的表达情况是乳腺癌预后的影响因素(P＜0.05),见表3。

表3 生存分析

基于COX单因素以及多因素的筛选构建TNBC的OS的列线图预测模型，见图5。在本研究中，1年生存率、2年生存率、3年生存率列线图模型的AUC分别为0.843、0.868、0.806，提示列线图模型有较好的区分度，见图6。

图5 预测TNBC总生存时间的列线图

图6 列线图预测患者1年、2年、3年总生存时间的ROC曲线

3 讨论

根据国际癌症研究机构最新报告显示，乳腺癌发病率已经超过肺癌，占所有肿瘤的11.7%，成为女性中最常见的癌症，是全球第五大癌症死因，也是女性癌症死亡的主要原因[2]。作为乳腺癌的一种特殊亚型，TNBC仍然是目前最具挑战性的一种[7]。主要采用的治疗手段仍然是手术为主，辅以放疗或化疗[8]。TNBC发生早期复发和远处转移的风险较其他类型的乳腺癌更高，给患者的身心健康带来了极大的负担和痛苦。因此，寻找精确的治疗靶点、以使患者获益，仍然是当前研究的焦点和难题。

AR是一种核受体[9]，基因位于Xq11-12号染色体上，有四个不同的功能区：N端区域、氨基末端的调节域（AF-1位点）、由两个锌指组成的DNA结合域、带有核定位信号的铰链区和C端配体结合域（AF-2位点），N端主要负责参与转录激活[10-12]。AR在乳腺癌癌变中的作用机制不是一成不变的，并且十分复杂。在没有配体的情况下，AR存在于细胞质中，并且与热休克蛋白及其伴侣复合物组成较为稳定的复合物[13]。当C端配体结合域结合循环中的雄激素，导致构象改变，使AR二聚体化。此时形成的受体-激素复合物由细胞核外进入到细胞核内，以促进由同一个激活剂介导的靶基因转录（AR激活的转录/基因组模式）进程，并通过负反馈作用使AR转录失活[13]。

乳腺癌是一种激素依赖性的肿瘤，AR在乳腺癌中的地位不可忽略。AR在正常乳腺组织与乳腺癌组织的表达水平略有不同[14]，在本研究中，AR在TNBC中的表达低于NTNBC的表达也证实了这一观点。文献中报道，AR在TNBC中的阳性表达占比超过30%，而且其表达水平在TNBC分子亚型中差异很大[15,16]。在本研究中，TNBC中AR阳性表达占比为33.0%，该结果与其他研究结果一致[17,18]。对于TNBC来说，研究[19]显示AR是一个坚实的潜在治疗目标。一项关于AR表达与TNBC相关性研究的meta分析结果显示，AR阳性与TNBC低复发风险相关[18]。进一步的研究将AR与更好的总生存期（P=0.04）联系起来。因此，类比前列腺癌中AR抑制剂的应用以及取得的有效成果，大量的AR抑制剂开始在TNBC中进行使用，目前研究较多的抑制剂，如比卡鲁胺、恩杂鲁胺、阿比特龙，在多项实验中均显示其在AR阳性表达的TNBC中能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖，增加细胞凋亡，减缓疾病的进程[20]。虽然,目前AR在TNBC中的具体作用机制还未明了，但现有的这些研究都能不同程度的验证AR抑制剂在TNBC预后中的积极意义。这些结果表明，AR为TNBC患者的靶向治疗展露了曙光。

核Ki67蛋白通常只在增殖细胞中表达[21]。Ki67在细胞间期主要位于核皮质，在有丝分裂期被招募到凝集的染色体上[22]。Ki67蛋白在除G0期外的G1，S，G2期和有丝分裂的细胞核中均能检测到[23]。免疫染色是Ki67表达的金标准[24]。Ki67指数在前列腺癌患者的预后中已成为独立的影响因素[25]。Ki-67指数是增殖活性的指标，并已被广泛研究为治疗反应的预测标志物[23,26]。多项研究[27,28]显示，获得pCR的患者与未获得pCR的患者相比，Ki-67的表达具有显著统计学意义。一些研究报道[29]显示，仅使用Ki-67表达不足以预测pCR，这表明预测模型还需要除Ki-67外其他标志物。AR阳性TNBC的Ki-67指数低于AR阴性TNBC，对化疗的敏感性可能较低[28]，在本实验中也验证这一结果。本研究中发现AR与Ki67的表达有相关性，因此在实验中将AR和Ki67进行融合，构建新的分类变量，以期望提高预测患者预后的准确性。本研究中的结果显示，AR（﹣）/Ki-67（﹢）表达的患者发生死亡风险是AR（﹢）/Ki-67（﹣）表达患者的5倍。AR（﹢）/Ki-67（﹣）表达的患者生存时间最长。

本研究仍存在一定的局限性。其一，样本均来源于朝阳市中心医院，因此样本的来源具有地域性，选择性偏倚无法避免；其二，本研究随访时间为3年，由于朝阳市中心医院TNBC患者量较少，横跨年限时间较长，因此部分患者出现失访，导致现有样本量不够充足的局限性，未对样本进行不同分子亚型的分组研究。另外，由于本研究是单中心研究，且样本量较为有限，因此未对列线图进行内部或外部验证，有待于扩大样本容量实施进一步的研究和验证。