蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立

2024-02-23马晓菁谷文喜刘丽娅谢彩云易新萍

新疆农业科学 2024年1期

马晓菁,谷文喜,叶锋,刘帅,刘丽娅,谢彩云,钟旗,易新萍

(新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830013)

0 引言

【研究意义】蓝舌病(Bluetongue,BT)由蓝舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)引起,属非接触性传染病,主要感染绵羊、牛等反刍动物。蓝舌病病毒为呼肠病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus),蓝舌病病毒亚群,是典型环状病毒属病毒。BTV存在大量基因、抗原变异且血清型众多,不同血清型间交叉反应较低或无交叉免疫保护反应。目前已确定的BTV血清型为1-27型BTV,28型和29型BTV正在鉴定中[1-2]。BTV基因组全长19 219 bp,由10个大小不同的节段分别编码7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4)[3-4], 其中由S3与S7基因编码的VP3与VP7蛋白共同构成病毒粒子的内层衣壳。VP7蛋白占内衣壳蛋白的36%,以三聚体形式存在,在不同BTV血清型中同源性高达94%[5-6]。VP7蛋白是BTV血清学检测中主要的群特异性抗原[7],常作为BTV血清学检测的理想靶抗原。但不同地域BTV分离株S7基因序列出现差异[8],使得BTV分子生物学检测及鉴定存在一定难度。【前人研究进展】YU等[9]在1988年完成了BTV-10的VP7基因全序列研究,并逐步分析了不同血清型VP7基因序列,研究结果确定了VP7蛋白作为群特异性抗原的分子基础。马洪超等[10]对BTV Z1株S7基因克隆并序列分析,序列分析结果可见VP7基因虽保守,但也存在较大的变化。李文超等[11]对BTV-5型S7基因序列比对分析,结果可见不同血清型S7基因ORF序列保守性相对较低,但其编码的氨基酸序列高度保守。近年来对VP7蛋白研究主要集中在BTV检测方法的建立,贾赟等[12]对BTV-25型VP7蛋白进行原核表达,结果表明VP7蛋白具有良好的免疫原性,为BTV蛋白芯片检测方法建立提供技术支持。臧明鑫等[13]对BTV-25型VP7蛋白单克隆抗体识别位点进行鉴定,序列分析表明氨基酸序列QYHAM 在BTV不同血清型的间保守,为BTV疫苗设计及高通量检测试剂盒研制奠定基础。王慧煜等[14]建立BTV VP7抗体胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,为蓝舌病检疫及监测提供快速筛查方法。孙雯等[15]原核表达BTV VP7蛋白,以纯化的VP7蛋白作为包被抗原,建立BTV-14型间接ELISA检测方法,可用于蓝舌病流行病学调查。【本研究切入点】我国多地发现了BTV 抗体呈阳性的动物[16]。1986年新疆检出山羊、绵羊以及牛均存在BTV血清学阳性[13],1990年分离到BTV,确诊了新疆地区BTV存在[17]。2012年再次对新疆8个地(州)的8个县(市)进行了BTV流行病学调查,结果显示蓝舌病在新疆地区仍然存在[18]。张玲等[19]在新疆尉犁县监控动物群中分离获得1株BTV-1型分离株。蓝舌病病毒具有血清型众多、变异快等特点,需进一步了解新疆地区BTV流行情况,建立快速诊断技术,控制其流行。【拟解决的关键问题】研究对1株蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列进行扩增,比对分析序列结果,设计引物,建立一步法RT-PCR方法,为新疆地区蓝舌病鉴定及疫苗研制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年9月于新疆尉犁县采集转阳前1周绵羊全血提取蓝舌病病毒RNA。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)提取RNA、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)提取DNA以及BHK-21细胞提取RNA,-80℃保存,均由新疆畜牧科学院兽医研究所布病室保存。

基因克隆载体PMD19-T、一步法RT-PCR试剂盒(Prime ScriptTMone step RT-PCR kit)均购自TaKaRa宝信生物工程(大连)有限公司,PCR mix购自北京庄盟公司,DNA回收纯化试剂盒及质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。反转录试剂盒(SuperScriptTMFirst-strand Synthesis System)购自Invitrogen公司,引物合成及测序服务由上海生工完成,二代测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 分离株蓝舌病NS1片段RT-PCR扩增

依照OIE手册提供引物进行巢式PCR[20]扩增,第一轮扩增引物:FA(5’-3’):GTTCTCTAGTTGGCAACCACC;RB:(5’-3’):AAGCCAGACTGTTTCCCGAT; 第二轮扩增引物FC(5’-3’) :GCAGCATTTTGAGAGAGCGA;RD(5’-3’):CCCGATCATACATTGCTTCCT扩增产物片段分别为272和101 bp。取BTV新疆分离株提取RNA 5 μL,95℃变性5 min为模板,RT-PCR反应体系25 μL,其中模板5 μL ,2×1 step Buffer(Dye plus)12.5 μL,PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL,上游引物FA(10 μM)0.5 μL,下游引物RB(10 μM)0.5 μL,ddH2O补足25 μL。第一轮扩增反应程序:45℃ 40 min,94℃ 2 min,1个循环;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s共40个循环;72℃延伸 5 min。以第一轮扩增产物为模板,进行第二轮扩增,反应体系为25 μL,其中模板1 μL,PCR mix 12.5 μL,上游引物FC(10 μM)1 μL,下游引物RD(10 μM)1 μL,ddH2O补足25 μL。反应程序:94℃预变性 1 min,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 20 s共35个循环,72℃延伸5 min,扩增产物送上海生工测序。

1.2.2 BTV新疆分离株S7基因序列获得

参照二代测序方法[21]将BTV新疆分离株提取RNA,按照反转录试剂盒程序反转录为cDNA,其中RNA 11 μL,引物(Radom Hexamer Primer 600 pmol/μL)2 μL,65℃ 10 min,然后体系中加入Transcriptor Reverse Transcripase Reaction Buffer(5×)4 μL;Protector RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL;Deoxynucleotide Mix (10 mM)2 μL;Transctiptase(20 U/μL)0.5 μL;RNase Out(40 U/μL)1 μL,25℃ 10 min,50℃ 50 min,85℃灭活5 min,立即冰浴,反转录cDNA送公司测序。测序结果与GenBank中已发表S7基因片段序列进行Blast比对,并利用软件MEGA5.0对序列进行差异分析。

1.2.3 BTV新疆分离株S7基因一步法RT-PCR方法的建立

1.2.3.1 分离株S7基因RT-PCR扩增

以分离株S7基因保守序列,利用软件Oligo6.0设计引物,筛选出扩增BTV新疆分离株S7基因RT-PCR特异性引物。取BTV新疆分离株提取RNA 5 μL,95℃变性5 min为模板,RT-PCR反应体系25 μL,其中模板5 μL ,2×1 step Buffer(Dye plus)12.5 μL,PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL,上游引物F-7X(10 μM)0.5 μL,下游引物R-7X(10 μM)0.5 μL,ddH2O补足25 μL。反应程序:45℃ 40 min,94℃ 2 min,1个循环;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s共40个循环;72℃延伸10 min,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。表1

表1 一步法RT-PCR扩增引物

1.2.3.2 一步法RT-PCR特异性

分别以BTV新疆分离株、牛病毒性腹泻病毒以及牛传染性鼻气管炎病毒提取RNA、DNA为模板,采用一步法RT-PCR方法扩增S7基因,以BHK-21细胞提取RNA作为阴性对照。

1.2.3.3 一步法RT-PCR敏感性

以BTV新疆分离株提取RNA为模板,进行S7基因片段RT-PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳,目的片段胶回收,并连接pMD19-T载体构建重组质粒,提取质粒测定浓度。分光光度仪测定BTV新疆分离株S7基因片段重组质粒浓度,利用公式(1),计算标准质粒拷贝数。10倍系列稀释重组质粒,进行RT-PCR扩增。

拷贝数(copies/L)=[6.02× 1023×质粒质量浓度(ng/mL)× 10-9]/[DNA长度(bp)× 660].

(1)

2 结果与分析

2.1 分离株NS1片段扩增结果

研究表明,两轮PCR产物分别出现272和101 bp目的条带,分离株与GenBank数据库中蓝舌病病毒编码NS1蛋白基因相似性为98.04%,为蓝舌病病毒分离株。图1

注：M:DNAMarkerDM2000;1-2:BHK 细胞提取RNA;3-4:BTV新疆分离株提取RNA

2.2 BTV新疆分离株S7基因序列

研究表明,新疆分离株S7基因序列与中国哈尔滨报道新疆BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道新疆BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%,与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%。

BTV我国新疆分离株S7基因序列与我国云南报道新疆BTV分离株S7基因序列(GenBank号:KX695176.1)、我国哈尔滨报道新疆BTV分离株S7基因序列(GenBank号:KX695176.1)以及蒙古国BTV分离株S7基因序列(GenBank号:LR877353.1)、德国BTV分离株S7基因序列(GenBank号:LR798447.1)比对,A/G碱基差异5处,T/C碱基差异9处,G/A碱基差异7处,C/T碱基差异4处,T/A碱基差异1处,共9处差异。232位氨基酸S氨基酸酸序列位氨基酸L氨基,272、290位氨基酸I氨基,297位氨基酸H氨基酸酸序列位氨基酸T氨 1 313位氨基酸L氨 S,316位氨基酸C氨基,324位氨基酸S→L。

2.3 BTV新疆分离株S7基因一步法RT-PCR扩增结果

2.3.1 一步法RT-PCR特异性

研究表明,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,仅BTV新疆分离株提取RNA扩增出1 010 bp目的条带,BVDV和IBRV分离株均未出现扩增条带。图2

注：M:DNAMarkerDL2000; 1:BHK细胞提取RNA;2:ddH20空白对照; 3:牛病毒性腹泻病毒提取RNA;4:牛传染性鼻气管炎病毒提取DNA;5:BTV新疆分离株提取RNA

2.3.2 一步法 RT-PCR敏感性检测结果

研究表明,BTV新疆分离株S7基因片段重组质粒浓度为168.57 ng/μL,计算标准质粒拷贝数,以4×105～4×100copies/μL进行RT-PCR扩增,该方法敏感性为4×103copies/μL。图3

注：M:DNAMarkerDL2000;1:BHK细胞提取RNA;2:标准质粒4×106copies/μL;3:标准质粒4×105copies/μL;4:标准质粒4×104copies/μL;5:标准质粒4×103copies/μL;6:标准质粒4×102copies/μL

3 讨论

3.1在我对国牛羊蓝舌病开展血清学调查中,新疆地区BTV抗体阳性率为14.91%[22],2016～2020年新疆地区共分离到3个血清型毒株[18,23-24],分别为BTV-1型、BTV-14以及 BTV-29型,其中BTV-1为我国主要流行血清型之一,BTV-14型与BTV29型仅在新疆分离获得。研究中BTV中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与蒙古国、德国BTV毒株VP7片段同源性分别为87.39%和80.70%,仅次于BTV-29型。检测到BTV-14型弱毒疫苗病毒[25]。

3.2BTV基因组包含10个分子质量不同的双链RNA,基因重配是基因组分节段RNA病毒进化的主要动力,可发生在任意一个节段上,使BTV呈现出高度的遗传多样性[26],并在在一定程度上反应出BTV的地理起源[27]。VP7蛋白是BTV的主要核心粒子,常作为BTV血清学检测理想靶抗原以及新型疫苗主要研究对象[28]。在对与中国新疆分离株具有同源性的S7基因序列间核苷酸与氨基酸比对分析,序列间存在核苷酸差异26处,氨基酸差异9处。

对BTV基因片段的克隆和序列分析,是追踪新毒株地域来源,以及分子流行病学调查的可靠方法之一,也是研究病毒遗传变异,亲缘关系的有效手段[10]。