橘汁发酵过程中柑橘香气及其贡献化合物的分析

陈小华，黄 微，党亚锋，朱 瑜，耿敬章，金文刚

（1 陕西理工大学生物科学与工程学院 陕西省资源生物重点实验室 陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室（培育） 陕西汉中723001 2 汉中市食品药品监督检验检测中心 陕西汉中 723000）

柑橘是世界第一大类水果，我国是全球最大的柑橘主产国，柑橘产量占全球总产量的27%，年产量超过3 000 万t，占全国水果产量的21%[1-3]。柑橘产业作为我国长江中、上游地区农业支柱产业和绿色经济的重要组成部分，在改善生态环境，提高橘农收入及出口创汇中均扮演着重要角色。近年来，随着我国柑橘产量的不断提高，柑橘初加工市场日渐饱和，产值日益下降，以柑橘果酒为代表的柑橘深加工产业受到越来越多的关注，并在发酵工艺[4-7]、酵母筛选[8-9]、脱苦[10-11]、澄清和陈酿技术[12-14]等方面取得了较大的研究进展。柑橘香气是柑橘果酒区别于其它种类果酒的重要香气属性之一，是决定柑橘果酒品质、市场价值和消费者接受度的重要因素[15-16]。然而，迄今为止对于柑橘香气在柑橘果酒酿造过程中的形成及影响机制少有报道。基于此，本研究以柑橘汁为试验材料，以柑橘香气及其贡献化合物以及异味物质为研究对象，通过研究橘汁发酵过程中柑橘香气及其贡献化合物和异味物质的变化，探讨柑橘酒酿造过程中柑橘香气形成过程及可能的影响因素，为今后该果酒香气品质提升提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 柑橘样品

城固蜜橘，采自陕西省城固县橘园，采收时间为2021 年11 月5 日。果汁可溶性固形物含量12.5%，总酸含量0.58 g/100 mL，固酸比16.4，还原糖2.76 g/100 mL，出汁率36.4%。

1.2 材料及试剂

发酵袋、纯净水，市售；果酒酵母，安琪股份有限公司；聚酰胺树脂、苯乙烯/二乙烯苯树脂、果胶酶、表1 中序号为1～10 和18～25 的化合物、表4中的异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸，上海安谱实验科技股份有限公司；表1 中序号为11～17 和26～29 的化合物，北京百灵威科技有限公司；二氯甲烷、乙醚、正戊烷、皂土、硫酸、饱和食盐水、氢氧化钠、无水硫酸钠、蔗糖、偏重亚硫酸钾和柠檬酸，国药集团化学试剂有限公司。

表1 鲜橘汁呈香物质鉴定结果Table 1 Identification of aroma compounds in fresh orange juice

1.3 仪器与设备

榨汁机，广东志高空调有限公司；LYT-330 型手持糖度计，昆山宏达光学仪器厂；固相萃取装置，青岛聚创环保集团有限公司；PHS-3C 型pH计，上海雷磁仪厂，CJJ78-1 型磁力搅拌器，常州市中贝仪器有限公司；TDL-5C 型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；SHA-2A 型恒温水浴锅，常州市万合仪器制造有限公司；正向硅胶色谱小柱，上海安谱实验科技股份有限公司；2010plus-TQ8040 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）、2010plus-OPV277气相色谱-人工嗅辨仪（GC-O），日本岛津。

1.4 试验方法

1.4.1 柑橘汁发酵 选取新鲜柑橘果实，清洗去皮后榨汁，向果汁中加入0.05%质量分数的果胶酶，40 ℃酶解60 min，加入蔗糖，调节糖度至25 Brix，加入偏重亚硫酸钾调整SO2质量浓度至50 mg/L，加入柠檬酸，调节pH 值至4.0，接入活化酵母（10 倍质量分数2%蔗糖水中加入0.3%酵母，40℃温育30 min），将果汁置于发酵袋中，于28 ℃连续发酵7 d。每天取样1 次，共7 份样品，保存于-20 ℃冰箱中，备用。

1.4.2 香气物质提取 向100 mL 0.2%皂土溶液中加入10 g 柑橘汁样品，搅拌混匀后室温（25 ℃）静置6 h，上清液加入聚酰胺树脂，室温搅拌过夜后，收集上清液并加入苯乙烯/二乙烯苯树脂，室温搅拌过夜后，收集树脂并加入二氯甲烷，搅拌混匀1 h 后收集二氯甲烷，获得橘汁香气粗提物。香气粗提物参考Joshi 等[17]报道的方法进行纯化，最终获得橘汁香气基性组分、酸性组分、水溶性组分和中性组分。

1.4.3 香气物质定性、定量分析 采用Chen 等[18]报道的方法，分析条件如下：色谱柱型号Inert-Cap-purWax（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm film thickness），离子源温度250 ℃，传输线温度230℃，进样口温度200 ℃，质谱扫描范围m/z 40～400，扫描速率1 scan/s，载气：氦气（流量1 mL/min）。分离程序：起始温度60 ℃，保持3 min，以3℃/min 速度升温至220 ℃，保持10 min，进样量1 μL，进样方式不分流进样。每个样品分析3 次以上，取平均值。香气物质定量分析采用内标法进行相对定量，内标物为癸酸乙酯（0.243 mg/kg），定性分析采用Nist2021 质谱库检索、标准品质谱比对结合保留指数法综合分析，保留指数使用正构烷烃混标（C9～C27），采用公式（1）计算。

式中，RI——保留指数；RT（x）——待测化合物的保留时间（min）；n 和n+1——待测化合物流出前、后正构烷烃的碳原子数；RT（n）和RT（n +1）——待测化合物流出前、后正构烷烃的保留时间（min）。

1.4.4 柑橘汁关键呈香物质鉴定 采用Chen等[18]报道的气味活性值（OAV）和GC-O 方法。分析条件如下：色谱柱型号InertCap-Wax（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm film thickness），进样口温度与分离程序如上所述，载气：氮气（流量1 mL/min），进样量2 μL，进样方法：不分流进样，样品在气相色谱端和嗅闻端的分离比为1∶1，嗅闻口的温度170 ℃，湿热空气流量为100 mL/min。嗅闻方法简述如下：7 名来自陕西理工大学生物科学与工程学院食品质量与安全专业的本科生（年龄20～22 岁，3 名男性，4 名女性）组成感官评价小组成员，在GC-O 分析的整个运行时间内，每名成员对嗅闻口端的流出物进行嗅闻并记录每个感知到的气味物质的气味特征和强度（强度范围：1～5，其中“1”为弱，“5”为强），每个小组成员进行3 次嗅闻试验，测得的香气属性的强度值为3 次嗅闻试验的平均值并取整数。

1.4.5 感官分析 参考牛云蔚等[19]的方法，略有修改。20 mL 不同发酵阶段橘汁样品装入棕色玻璃瓶中，上述7 名感官评价小组成员对样品中的柑橘香气强度进行描述和评分（强度范围：0～5，其中“0”为无，“5”为强）。

1.4.6 数据处理 采用WPS Excel 2019 软件对香气物质相对含量进行统计分析，差异显著性和相关性分析采用SPSS22.0 软件。

2 结果与分析

2.1 柑橘香气贡献化合物鉴定

GC-MS 结合气味活性值（OAV）和GC-O 分析结果显示（表1），从鲜橘汁中共鉴定出29 种呈香物质，主要由果香气（OAV平均值=206；气味强度平均值=2.8）、柑橘香气（OAV平均值=87；气味强度平均值=2.9）、花香气（OAV平均值=1 092；气味强度平均值=2.5）、清香气（OAV平均值=39；气味强度平均值=3）和乳脂香气（OAV平均值=2.5；气味强度平均值=2）化合物构成。OAV 分析结果显示，2-甲基丁酸乙酯（果香气）和芳樟醇展示了较高的OAV 值，分别为1 000 和4 932，其次为柠檬烯（柑橘气味）、己酸乙酯（菠萝气味）、辛醛（柑橘气味）、α-松油醇（丁香气味）、香茅醇（柑橘气味）和丁香酚（丁香气味），其OAV 值范围在110～261 之间，其余呈香物质的OAV 值则较低。GC-O 分析结果显示，2-甲基丁酸乙酯、辛醛和芳樟醇的气味强度最高（5.0；强），其次为己醛、柠檬烯、香茅醇和丁香酚，其气味强度值为4.0（较强）。此外，月桂烯、反式-2-已烯醛、己酸乙酯、癸醇、叶醇和α-松油醇也展示了中等的气味强度（3.0）。相似的结果在前人的研究中也有报道，如Buettner 等[20]、Arena等[21]、Kumazawa 等[22]和Mastello 等[23]从鲜榨柑橘汁从中鉴定出己醛、月桂烯、柠檬烯、辛醛、壬醛、香兰素等多种高OAV 气味物质。

如图1 所示，柑橘香气是柑橘汁香气结构中的重要香气属性之一，柑橘汁中类似柑橘气味特征的香气物质在柑橘香气属性形成中扮演重要角色[16，20]。在本研究中，柑橘汁香气提取物经GC-O和OAV 分析共鉴定出月桂烯、庚醛、柠檬烯、γ-松油烯、癸醇、辛醛、辛醇、香茅醇和橙花醇等9 种柑橘香气贡献化合物。

图1 基于GC-O 和香气强度分析的柑橘汁香气轮廓Fig.1 Aroma profile of orange juice based on GC-O and aroma intensity analysis

固相微萃取提取技术（SPME）因其操作简便及萃取浓缩一步到位的优点，成为目前柑橘香气物质提取最常使用的方法[4-9]，然而该方法由于受到萃取头容量限制及纤维素膜选择性吸附的影响，对香气物质的吸附效率比较有限[15]。因而，本研究使用固相萃取技术[18]结合Joshi 等[17]的正向硅胶色谱分离方法对柑橘汁中的香气物质进行高效萃取，将香气物质分离为基性组分（I）、酸性组分（II）、水溶性组分（III）和中性组分（IV）。相较于传统SPME 方法，该方法可大大降低香气物质色谱分离过程中的峰重叠的出现，提高了定性准确性[24]。使用该方法，本研究从鲜橘汁中还鉴定出2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、异戊醇、乙酸芳樟酯、香茅醇和橙花醇等新的气味物质，这些气味物质在其它文献中少有报道。

2.2 柑橘香气及其贡献化合物在橘汁发酵过程中的变化

对柑橘香气在橘汁发酵过中的感官分析显示，鲜橘汁在发酵1～4 d 的过程中，柑橘香气强度呈逐渐增强的趋势，随后则逐渐减弱并呈现出浓烈的酸败和刺激性气味（表2）。相似的，伴随柑橘香气的增强，其贡献化合物含量亦呈现显著增加的趋势，在发酵第4 天，含量平均增加了约2～15倍（表3），随后则显著下降。Pearson 相关性分析结果显示，柑橘香气强度的变化与柠檬烯、γ-松油烯、辛醇和橙花醇含量增减有显著相关性（P＜0.05）。该结果表明，上述香气物质在柑橘香气形成中扮演了重要角色，是柑橘香气的关键贡献化合物。相似的变化趋势在康明丽等[4]的研究中也有报道，该研究结果显示，柑橘汁在发酵7～35 d 的过程中，包括柠檬烯在内的多种香气物质的含量也呈现先增加后减少的趋势。游离态和糖苷键合态是柑橘汁中香气物质存在的两种主要状态，游离态香气物质可被直接感知，而糖苷键合态香气物质则无气味[26-27]。柑橘汁在发酵初期香气物质含量显著增加，可能与柑橘汁发酵过程中，糖苷键合态香气物质在酸或糖苷酶的水解作用下，形成游离态芳香化合物，从而使发酵橘汁中的香气物质含量不断增加有关[28]。

表2 柑橘香气在橘汁发酵过程中的变化Table 2 Changes of orange characteristic aroma during orange juice fermentation

表3 柑橘香气贡献化合物在橘汁发酵过程中的变化Table 3 Change of orange -like aroma compounds during orange juice fermentation

2.3 橘汁发酵过程中异味物质的产生和变化

感官分析显示，橘汁发酵4 d 后，伴随柑橘香气减弱，酸败和刺激性气味呈现逐渐增强的趋势（表2），这与橘汁发酵后期异味化合物大量产生有关。成分分析结果显示，在橘汁发酵后期，一些异味化合物，如异丁酸（刺激性难闻气味）、丁酸（刺激性难闻气味）、2-甲基丁酸（刺激性气味）、戊酸（汗臭和腐臭味）、己酸（汗液酸臭味）、庚酸（脂肪酸败味）和辛酸（酸败和汗臭气味）的含量呈显著增加的趋势（表4），这些异味物质对果酒中柑橘香气具有显著的遮盖作用[29-31]。

表4 橘汁发酵过程中异味化合物的变化Table 4 Change of off-odorants during orange juice fermentation

3 结论

采用GC-MS 结合气味活性值（OAV）和GCO 方法从鲜橘汁中鉴定出29 种香气物质，主要由果香气、柑橘香气、花香气、清香气和乳脂香气化合物构成，其中月桂烯、庚醛、柠檬烯、γ-松油烯、癸醇、辛醛、辛醇、香茅醇和橙花醇等化合物被鉴定为柑橘香气贡献化合物。在柑橘汁发酵过程中，柑橘香气强度及其贡献化合物含量均呈先增加后降低的趋势，二者呈正相关，糖苷键合香气化合物在橘汁发酵过程中，水解为自由态香气化合物可能是柑橘香气贡献化合物显著增加的重要原因。伴随柑橘香气强度及其贡献化合物含量的降低，异味化合物含量则呈显著增加的趋势，其对柑橘香气具有显著的遮盖作用。