人源长双歧杆菌长亚种i772 的分离、鉴定及特性研究

张 栋，冯丽莉，荀一萍，薛玉玲，宁一冰，王世杰

（君乐宝乳业集团股份有限公司 石家庄 050221）

双歧杆菌由法国巴斯德研究所的Tissier 于1900 年从母乳喂养的婴儿粪便中首次分离得到[1]。随着研究的深入，双歧杆菌已成为众所周知的一类益生菌，具有调节肠道菌群[2-4]、抗肿瘤[5-7]、降胆固醇[8-9]以及延缓衰老[10-11]等功能性。另外，双歧杆菌已成为评价肠道菌群健康的重要参考指标。尤其在生命早期的婴儿肠道菌群中，双歧杆菌的种类和相对丰度对婴儿健康和后期成长都有重要作用[12-13]。在益生菌开发中，一般认为健康人体，特别是健康婴儿肠道样本是理想的益生菌来源。日本科学家就根据其不同寄宿环境将双歧杆菌分为人类亲和型双歧杆菌（Human-residential bifidobacteria，HRB）和非人类亲和型双歧杆菌（Nonhuman-residential bifidobacteria，NHRB）[14]。常见的HRB 包括长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp.longum）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）、长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp.infantis）、两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）。研究表明HRB 由于能够更好地利用母乳低聚糖并耐受溶菌酶，因此HRB 具有更好的肠道定植能力，是更适合人体尤其是婴幼儿的益生菌[15-18]。

我国对于双歧杆菌的研究和开发较晚。市售益生菌酸奶中的双歧杆菌以欧美和日本厂商开发的少数几种菌株为主，限制了益生菌酸奶产品开发的多样性，也无法满足消费者对于益生菌酸奶的需求。

本试验从健康婴儿粪便样品中分离得到1 株疑似双歧杆菌，对其进行分子生物学鉴定，研究其消化液耐受能力、免疫调节作用以及发酵特性，以期为我国益生菌发酵乳提供优良的双歧杆菌，为我国自有双歧杆菌的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

婴幼儿粪便：君乐宝乳业集团收集的健康顺产婴儿新鲜粪便样品，于-80 ℃冰箱备用。

1.2 试剂与仪器

API50 试剂盒，法国梅里埃；莫匹罗星锂盐配套试剂、天根细菌DNA 提取试剂盒、蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉等均为生物纯级，北京陆桥技术股份有限公司；葡萄糖、KH2PO4等均为分析纯级，石家庄现代仪器仪表化工有限公司；脱脂乳粉，雀巢（中国）有限公司；THP-1 细胞、细胞总RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR 及电泳所用试剂，河北本源生物科技有限公司；生牛乳，君乐宝乳业集团。酸奶发酵剂JLB-1510，河北一然生物科技有限公司。

人工胃液：NaCl 0.2 g/100 mL、胃蛋白酶（Pepsin）0.35 g/100 mL，用浓度为1 mol/L 的HCl调整pH 值为3.0 后，过滤除菌，备用。人工肠液：将下述a 液和b 液以体积比2∶1 混合即为人工肠液。a.胰腺液：重碳酸钠1.1 g/100 mL，NaCl 0.2 g/100 mL，胰蛋白酶（Trypsin）0.1 g/100 mL，调整pH值为8.0，过滤除菌，备用。b.胆汁液：Bile Salts（Difco）0.9 g/100 mL，调整pH 值为8.0，过滤除菌，备用。

生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；CML51 生物显微镜，日本奥林巴斯公司；净化工作台、高速离心机、荧光定量PCR 仪，赛默飞世尔科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，日本雅玛拓公司。

1.3 培养基

改良固体MRS 培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐温80 mL/L，乙酸钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，L-半胱氨酸0.5 g/L，琼脂15.0 g/L，蒸馏水1 L，pH 6.2～6.5。倒平板前每100 mL 培养基加入1 支莫匹罗星锂。

改良液体MRS 培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐温80 mL/L，乙酸钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，L-半胱氨酸0.5 g/L，蒸馏水1 L，pH 6.2～6.5。

1.4 试验方法

1.4.1 双歧杆菌的分离、纯化和保存 取备用粪便样品1 g 至9 mL 无菌生理盐水中，振荡混匀后，继续使用无菌生理盐水进行10 倍梯度稀释。取不同稀释梯度稀释液100 mL 至提前准备好的改良MRS 固体培养基平板，涂布。将涂布好的平板置于厌氧罐，37 ℃静置培养48 h。观察平板长出的菌落，挑选不同形态特征的单菌落，进行连续的平板划线传代直至在平板上得到形态单一菌落。拍照记录菌落形态，并进行简单染色观察其显微形态。

纯化后的菌株接种于改良MRS 液体培养基，过夜培养后以培养液与50%的灭菌甘油以体积比1∶1 混合后，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.2 分离菌株的鉴定 使用菌落及显微形态观察、API50 发酵试验和16S rDNA 序列分析对菌株进行分类地位鉴定。

1.4.3 抗生素抗性试验 采用K-B 法测定菌株对30 种抗生素的敏感性。判定结果依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准[14]。

1.4.4 人工消化液耐受试验 将冻存的待测菌株使用改良MRS 液体培养基活化，连续传代3 次。取1 mL 培养液加入9 mL 人工胃液中，振荡均匀，至于37 ℃静置培养，0 h 和培养2 h 分别取样测定其活菌数。取在人工胃液中2 h 的培养液1 mL，加入9 mL 人工肠液中，继续置于37 ℃下培养，并分别在0，4 h 取样，测定其活菌数。

式中，N1——经人工消化液处理6 h 的活菌数，CFU/mL；N0——经人工消化液处理0 h 的活菌数，CFU/mL。

1.4.5 免疫调节作用 将冻存的待测菌株使用改良MRS 液体培养基活化，连续传代3 次，取1 mL培养液4 000 r/min 离心8 min，PBS 洗涤1 次后，用细胞培养液重悬，调整菌浓度至106CFU/mL 左右，得到重悬液，备用。将THP-1 细胞浓度调整为105个/mL，去除原培养液加入重悬液，孵育3 h 后去除重悬液，PBS 洗涤2 次后使用PBS 重悬细胞，1 000 r/min 离心5 min 收集细胞。按照RNA 提取试剂盒说明书提取各孔细胞的总RNA。另设仅加入培养液的对照组。

按照反转录试剂盒说明书进行各组RNA 的反转录，得到cDNA。

以cDNA 为模板进行荧光定量PCR，反应引物见表1，反应体系见表2，反应程序见表3。结果根据相对定量的计算公式：2-△△Ct，其中-△△Ct=-[Ct（目的基因，试验组）-Ct（内参基因，试验组）]-[Ct（目的基因，对照组）-Ct（内参基因，对照组）]。

表1 细胞因子及其引物序列Table 1 Cytokines and primer sequences

表2 荧光定量PCR 反应体系Table 2 Quantitative fluorescence PCR reaction system

表3 三步法反应程序Table 3 Three-step reaction procedure

1.4.6 发酵乳制备及评价 取传代活化后的i772菌液10 mL，12 000 r/min 离心10 min 后弃上清，使用生理盐水重悬后再次离心，重复3 次得到i772 菌泥备用，另取1 mL 菌液进行活菌计数。称取JLB-1510 发酵剂1～1.2 g，溶解至200 g 生灭菌牛乳中，混匀得种子液。取生牛乳2 kg，按7%比例加入蔗糖，升温至65 ℃均质后，95 ℃沸水浴灭菌10 min，降温至50 ℃。以10 mL/kg 接种量加入种子液，同时，将i772 菌泥加入灭菌生牛乳充分混匀，42 ℃静置发酵至pH 4.5 左右，破乳后4 ℃静置过夜。

召集专家级感官评价人员（23 人）对其进行综合评价。感官评价方法为整体口感喜好度，用9点强度标度法（9→1 表示喜欢→不喜欢，＜5 表示不被喜欢），其它感官特性用10 点强度标度法（10→0 表示极强→察觉不到）。采用此方法对上述发酵乳样品进行整体喜好度、香气、甜味、酸味、黏稠度、细腻度评价。

1.5 数据分析

使用SPSS 软件对试验数据进行分析并通过Origin 2018 作图。PCR 扩增产物鉴定后所得序列，在NCBI 中的BLAST 检索系统数据库中进行比对确定，使用Bioedit 软件和mega7.0 软件进行邻接法系统发育树作图。

2 结果与分析

2.1 菌株分离及鉴定

经过分离、纯化，得到1 株形态特征疑似双歧杆菌的菌株，编号为i772。其菌落形态和显微特征如图1 所示。菌落圆形凸起，微白不透明，显微镜下呈棒状和分支状，单生、V 字排列。API50 试验证明其可以利用D-乳糖、L-阿拉伯糖、乳糖、果糖、棉籽糖等（表4）。

图1 i772 的菌落形态（a）和显微形态（b）Fig.1 Colony morphology（a）and microscopy morphology（b）of i772

表4 i772 的API50 试验结果Table 4 API50 experimental results for i772

表5 长双歧杆菌长亚种i772 的抗生素抗性试验Table 5 Antibiotic resistance experiments of i772

进一步，将测序得到的DNA 序列利用NCBI中 的 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将其进行同源性分析，发现i772 与长双歧杆菌长亚种同源性最高达到99%，将待鉴定菌株与部分双歧杆菌不同种的模式菌株的16S rDNA 序列一起，以植物乳杆菌模式菌株作为外群，采用邻接法制作系统发育树。由图2 可知，i772 与长双歧杆菌长亚种ATCC15707 聚为一类。因此，根据理化结果和基因分析结果将i772 鉴定为长双歧杆菌长亚种i772（Bifidobacterium longum subsp.Longum i772）。

图2 基于16S rDNA 序列的i772 系统发育树Fig.2 The i772 phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences

2.2 i772 的抗生素耐受试验

乳酸菌尤其是双歧杆菌一般认为是安全的，然而随着基因技术和转基因乳酸菌的出现，菌株的抗生素耐药性成为益生菌应用前值得关注的问题。通过K-B 法检测长双歧杆菌长亚种i772 对30 种抗生素的敏感性发现，长双歧杆菌长亚种i772 对其中25 种抗生素敏感，安全风险较低。

2.3 i772 的人工消化液耐受试验

益生菌能够以活菌形式到达肠道才能更好的定植和发挥其健康作用。因此能否耐受到达肠道前的酸碱胁迫是评价其能否发挥健康功能的重要指标。表6 可以看出长双歧杆菌长亚种i772 在初始活菌数为6.90×108CFU/mL 时，经过2 h 胃液和4 h 肠液处理后存活率达到3.22%。其中，在胃液中2 h 存活率为3.07%，在肠液中活菌数不仅没有下降还略有增长，这一结果与其它研究报告结果相似[22-23]。这可能与人工肠液与长双歧杆菌长亚种i772 分离自健康婴儿肠道的原生环境相似有关。提示长双歧杆菌长亚种i772 在肠道环境中具有生长定植的潜力。

表6 长双歧杆菌长亚种i772 的消化液耐受试验Table 6 Digestion solution tolerance experiment of i772

2.4 i772 的免疫调节作用

IL-8 的主要生物学活性是吸引和激活中性粒细胞，这些作用可导致机体局部的炎症反应，达到杀菌和细胞损伤的目的[24]。TLR 基因编码的蛋白质是Toll 样受体（TLR）家族的成员，该家族在病原体识别和先天免疫激活中起着基本作用。能够介导免疫力发展所必需的细胞因子的产生。TNFα 是一种促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应[25-26]。由图3 可知，i772 与THP-1 细胞相互作用3 h 后，细胞因子IL-8、TLR4、TNF-α mRNA的表达量为对照组的12.71，5.71，12.56 倍。因此i772 能够促进THP-1 细胞中促炎因子表达，具有一定免疫激活和增强作用。

图3 长双歧杆菌长亚种i772 干预THP-1 细胞炎症相关基因的相对表达量Fig.3 Relative expression levels of genes related to inflammation in the i772 intervention in THP-1 cells

2.5 i772 的发酵乳制备及风味评价

将制备好的含有长双歧杆菌长亚种i772 的发酵乳与未添加的普通发酵乳，召集专家级感官评价人员23 人对其进行综合评价。结果如表7 所示，加入i772 对于发酵乳的总体喜好度、总香气、酸味、甜味和粉感的影响没有显著性差异；显著提高了发酵乳的口中黏度和黏聚性。李达等[27]通过研究不同菌株发现，乳酸菌产生胞外多糖可以改善发酵乳的质构，发酵乳更细腻，同时提高了黏度和黏附性。李胜杰[28]研究了两歧双歧杆菌WBIN03其胞外多糖产量可达240 mg/L 左右。推测含i772的发酵乳口中黏度和黏聚性的提高，可能与其在发酵过程中产生胞外多糖，从而改变了发酵乳质构特性有关。胞外多糖的产生除了能够提升发酵乳的质构，也会赋予益生菌良好的健康作用[29-31]，这还需要后续试验进一步验证。

表7 长双歧杆菌长亚种i772 发酵乳感官评价结果Table 7 Sensory evaluation results of fermented milk of i772

3 结论

从健康婴儿肠道样品中分离得到1 株疑似双歧杆菌菌株，经过生理生化鉴定为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌长亚种i772。进一步做抗生素抗性试验发现其对25 种抗生素敏感；通过胃肠消化液的存活率为3.22%；能够提高IL-8、TLR4 和TNF-α 3 种促炎因子的mRNA 相对表达量。通过发酵和品尝发现添加长双歧杆菌长亚种i772 对发酵乳的喜好度、香气等指标无显著影响，而显著提高了发酵乳的口中黏度和黏聚性。未来将进一步从HRB 菌株和胞外多糖方向继续进行研究。