望江南茎提取物的抑菌活性成分分析

杨 瑾, 张一宁, 张玉红*

(1.东北林业大学 森林植物生态学教育部重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江省林源活性物质生态利用重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150040; 3.东北林业大学化学化工与资源利用学院,黑龙江 哈尔滨 150040)

致病菌的盛行以及对抗生素耐药性的日益增强,对人类健康造成了一定的威胁。天然产物由于具有不易产生耐药性、生物相容性好等特点,研究开发一些天然产物来替代抗生素成为近年来的热点[1]。如孙长花等[2]发现丁香中的丁香酚为主要抑菌物质,吴萌萌等[3]发现黄酮类成分是苦荞提取液的主要抑菌物质,王洪斌等[4]研究发现菱角壳提取物的抑菌活性较强,可能源于其中没食子酸等成分。

望江南为豆科决明属一年生草本植物,全株均可药用[5],该植物含有丰富的蒽醌和黄酮类物质及其衍生物[6-7]。据文献记载望江南常用来治疗痢疾、创口感染[8]。科研人员研究了望江南提取物的抗菌活性,发现其具有一定的广谱抗菌性,例如对白喉杆菌、毛霉菌、诺卡氏菌、沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉[9],以及多杀巴斯德菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、肺炎杆菌[10-11]都有一定抑制作用。但是,目前关于望江南的研究还局限于对粗提物的工艺优化以及对总蒽醌等成分含量的检测,对望江南抗菌活性成分的研究较少且多集中于粗提物的抑菌分析,并没有深入探究。因此,本研究分析了望江南茎不同极性溶剂萃取物对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、鲍曼不动杆菌(革兰氏阴性菌)、白色念珠菌(真菌)3种类型常见致病菌的抗菌活性,同时结合柱层析、质谱等方法来分离和分析其发挥主要抑菌效果的化合物成分,以期为望江南活性成分在天然抑菌剂方面的开发利用提供基础数据。

1 实 验

1.1 材料与仪器

望江南(Sennaoccidentalis(Linnaeus) Link)茎,东北林业大学植物生态教育部重点实验室种植基地;肉汤培养基、LB琼脂培养基,北京陆桥公司;大黄素标准品、大黄酚标准品、大黄素甲醚标准品,纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司;青霉素(ST488-1),碧云天生物技术公司;无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚,分析纯,上海麦克林公司;甲醇,色谱级,默克生物科技公司;柱层析硅胶,75 μm,上海麦克林公司;25 mm×80 mm薄层层析板,烟台黄海公司;200 mm×0.5 mm毛细点样管,长城科学仪器;0.22 μm微孔滤膜,津腾公司。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii),本实验室保藏菌种。

Cl-CJ-2N无菌操作台,哈尔滨市东联电子公司;THZ-Q卧式全温振荡器,常州智博瑞仪器制造有限公司;KQ-400KDE超声清洗仪,昆山市超声仪器有限公司;M200酶标仪,瑞士迪肯公司;Q-Exactive液相色谱-四极杆轨道阱质谱联用(UPLC-MS/MS)仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 不同极性萃取物的制备

新鲜望江南茎晒干后粉碎,过0.425 mm筛,称取100 g望江南茎粉末,料液比为1∶10(g∶mL),采用80%乙醇超声波提取3 h,反复抽滤后将澄清液旋干得到浸膏,加水溶解后按有机溶剂极性从小到大依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取,将分离后剩余部分过滤除去乳化层作为水萃取液部分。将4个萃取组分和超声波提取液旋转蒸发溶剂后,分别用无水乙醇溶解配置成质量浓度为50 g/L的乙醇溶液。

1.3 分馏组分的制备

1.3.1薄层色谱(TLC)制备 将1.2节中氯仿萃取液通过毛细管点样在TLC薄层色谱板上,在石油醚-乙酸乙酯(体积比15∶5)体系中展开,在365 nm紫外光照射下,根据显色情况将其分成3个组分,分别为组分Ⅰ、组分Ⅱ和组分Ⅲ。

1.3.2柱层析制备及分离 层析柱制备及分离纯化:采用湿法装柱干法上样的方法。湿法装柱:取一根(300 mm×30 mm)规格的玻璃层析柱,将硅胶30 g与洗脱剂混合均匀后加入柱内,敲击柱身减少气泡后加压使填料平整。干法上样:将氯仿萃取物与少量硅胶混合后旋转蒸发至无液体干粉状态,平铺在层析柱里的填料上,使用少量洗脱剂完全浸润。

使用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系(体积比19∶1∶0～10∶8∶2)洗脱色谱柱,每50 mL换瓶收集,每瓶通过TLC检验结果,将不同馏分根据TLC结果进行合并处理,并分为组分1、组分2和组分3。

1.4 抑菌活性检测

选取金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和鲍曼不动杆菌分别进行抑菌圈、最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定,以探究望江南抑菌活性成分的抑菌效果,抑菌实验均在无菌台上操作。

1.4.1菌种活化 将菌种接种于肉汤培养基37 ℃培养活化12 h,取指数生长期菌液,稀释一定倍数至含菌量约为1×106CFU/mL。

1.4.2抑菌圈(ZOI)实验 抑菌实验采用滤纸片扩散法。分别滴加10 μL供试液至直径为6 mm的滤纸片上,自然风干,备用;以质量浓度为25 mg/L青霉素为阳性对照,无水乙醇为空白对照。准确吸取100 μL菌悬液均匀涂布在LB琼脂培养基上,而后将自然晾干的滤纸片用镊子依次平放至平板上,于37 ℃培养箱中培养24 h。采用ImageJ软件量取抑菌圈直径,每组实验重复3次。

1.4.3MIC和MBC的测定 在96孔板2～8孔中分别加入100 μL菌液,在孔1中加入160 μL菌液和40 μL一定质量浓度的药液,然后在孔1中吸取100 μL到孔2,按照该操作依次稀释到孔8,多余的液体弃置,最后得到质量浓度依次为上一个药液浓度1/2的浓度梯度,使用移液管抽吸液体操作重复2次,使其在孔内混合均匀。在第二列加入100 μL菌液和100 μL同等青霉素药液作为阳性对照组,在另一空白列放置200 μL菌液作为空白对照组。放入培养箱12 h后,通过肉眼比对发现微孔内液体澄清透明并且经振荡后无浑浊变化,则此微孔对应的药液浓度即为此样品对供试细菌的MIC。再将对应MIC两倍浓度的微孔中的液体均匀混合后,取100 μL涂布在固体培养基平板上,在37 ℃培养箱内继续培养24 h,仍然无菌落生长的最低药物浓度为样品的MBC。

1.5 抑菌成分分析

1.5.1液相色谱质谱串联分析及验证

1.5.1.1UPLC-MS/MS分析方法建立 色谱条件:色谱柱为Hypersil GoldTMVanquish C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm),流动相为体积分数0.15%的甲酸水溶液(A)、体积分数0.1%的甲酸乙腈溶液(B);梯度洗脱程序为5% B液(0.00～0.45 min)、 5%～100% B液(>0.45～30.05 min)、 100% B液(>30.05～34.27 min)、 100%～5% B液(>34.27～34.7 min)、 5% B液(>34.7～38.5 min);流动相流速为0.4 mL/min,进样量为2.0 μL。

质谱条件:采用电喷雾离子源正负离子模式,其中正离子模式具体参数为毛细管温度350 ℃,喷雾电压4.0 kV,鞘气、辅助气和吹扫气流量分别为80、 40、 0(任意单位),S-lens射频水平为75 V;负电离模式具体参数为毛细管温度350 ℃,喷雾电压3.7 kV,鞘气、辅助气和吹扫气流量分别为18、 2、 0(任意单位),S-lens射频水平为75 V。数据采集模式:Full MS-ddMS2模式,其中全扫描质谱采集,质量分辨率设定为70 000 FWHM,扫描范围(m/z)为15～1 500,二级质谱数据采集质量分辨率设定为17 500 FWHM,碰撞能为10、 30、 50 eV。

1.5.1.2样品测试 将柱层析分馏的组分1进行旋蒸,甲醇溶解后,一次性注射器配合0.22 μm微孔滤膜过滤,上机检测。

1.5.2化合物分离纯化 根据蒽醌的特殊化学性质,对组分1使用pH值法粗分离和层析柱纯化操作,分别得到大黄素(纯度95.8%)、大黄酚(纯度95.8%)、大黄素甲醚(纯度94.6%)3种蒽醌类化合物。

1.5.3抑菌活性验证 将分离得到的3种化合物溶液旋干溶剂后,加入无水乙醇配置成100 g/L的药液。按照1.4.3节方法测定3种化合物的MIC和MBC,验证其抑菌效果。

1.6 数据处理

所有实验都重复3次,数据取平均值。不同菌落的抑菌圈排列不完全规则,利用ImageJ软件通过面积精确计算圆周直径。采用Origin进行数据处理,采用SPSS 24.0软件进行统计分析,计算其平均值与标准差,并进行方差分析,差异显著性水平小于5%(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 薄层色谱鉴别

根据1.3.1节中薄层色谱展开的方法,得到的薄层色谱图及其分组情况见图1。由图1可知,望江南茎中的成分较为复杂,根据极性和物质洗脱顺序难易程度综合考虑分为3组:组分Ⅰ、组分Ⅱ和组分Ⅲ。

图1 样品薄层色谱Fig.1 Thin-layer chromatogram of sample

2.2 抑菌结果分析

2.2.1不同极性萃取物的抑菌圈测定 不同极性萃取物对鲍曼不动杆菌(G-)、白色念珠菌(真菌)、金黄色葡萄球菌(G+)的抑菌结果见表1。由表1可知,4种极性萃取物对供试菌均有一定的抑制效果,其中氯仿萃取物对白色念珠菌的抑制效果最强,抑菌圈直径>20 mm,而水萃取物的抑菌效果最弱。整体抑菌效果由强到弱排序为:氯仿萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物>超声波提取液>水萃取物。从数据上看,氯仿萃取物的抑菌活性要远大于其它几种溶剂萃取物,可以推断出发挥主要抑菌作用的活性成分为氯仿提取物中的化合物。

表1 望江南茎中4种极性萃取物(50 g/L)的抑菌圈直径1)

2.2.2氯仿萃取物馏分抑菌圈测定 将具有明显抑菌效果的氯仿萃取物进一步通过层析柱分离出3个组分,分别对其进行抑菌圈测定,结果见表2。由表2可知,鲍曼不动杆菌和白色念珠菌组在3个组分抑菌圈测定中差异显著(P<0.05),并且根据抑菌圈直径大小对比,可以明显看出组分1的抑菌效果更显著。组分1和组分2在365 nm紫外光照射下分别呈现明显的黄色和橙色荧光,与蒽醌类物质在紫外光下的特征相似,分析组分1和组分2中主要成分可能为蒽醌类化合物。

表2 氯仿萃取物中不同馏分(50 g/L)的抑菌圈直径

2.3 组分1质谱分析

2.3.1LC-MS分析 按1.5.1节方法,对组分1进行液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析,总离子流图见图2。通过对比本地数据库及Compound discovery 3.0软件,结合MoNA线上数据库(https:∥mona.fiehnlab.ucdavis.edu/)及人工分析共检索出22个化合物,其中18种为负离子模式下检出,4种为正离子模式下检出。22个化合物中黄酮类及其衍生物共7个,蒽醌类物质共13个,多酚类物质1个,香豆素类物质1个。利用面积归一化法计算含量,结果见表3。结果显示:黄酮类和蒽醌类化合物占比较大,质量分数分别为33.47%和12.59%。根据分析取含量较高的3种蒽醌类物质大黄素、大黄酚和大黄素甲醚,进一步研究其抑菌活性。

表3 组分1正负离子模式下的部分化合物鉴定

a.负离子流ESI-; b.正离子流ESI+

2.3.2化合物的鉴定 化合物1的二级质谱图见图3(a)。由图3(a)可知,负离子模式下扫描的m/z253.05为[M-H]-峰,表明该化合物的相对分子质量为254。根据主要碎片离子为225.06,可推断出此为丢失1个CO-碎片形成的峰,然后继续断裂侧链中的甲基基团形成210.03碎片峰,继而继续断裂另一个对位的CO-形成182.04碎片峰,最后断裂酚羟基及邻位的碳CO-形成154碎片峰[28],根据质谱数据和裂解规律推断为大黄酚。

a.化合物1 compound 1; b.化合物2 compound 2; c.化合物4 compound 4; d. 化合物5 compound 5; e.化合物19 compound 19

化合物2的二级质谱图见图3(b)。由图3(b)可知,负离子模式下扫描的m/z269.04为[M-H]-峰,表明该化合物的相对分子质量为270。该化合物有2种裂解方式:一种是断裂CO-形成241.05碎片峰;另一种是先丢失CO-和酚羟基键形成225碎片峰[29],其后断裂规律与大黄酚的一致,推测该物质为大黄素。

化合物5的二级质谱图见图3(d)。由图3(d)可知,负离子模式下扫描的m/z283.06为[M-H]-峰,表明该化合物的相对分子质量为284。最先丢失侧链[M-H-C2H3O]-形成240.04碎片峰,进一步丢失CO-形成212.04碎片峰,进而丢失对位CO-形成184.04碎片峰,质谱反相柱的出锋时间为16.71 min,对比大黄酚极性较弱,推测该物质为大黄素甲醚。

化合物19质谱图(图3(e))中m/z285.24表明其为母离子,则该物质相对分子质量为286。断裂发生在C环上的C—C键与C—O键,形成133.03的碎片峰,比对文献发现其断裂特征和木犀草素一致。该断裂规律也适用于化合物20槲皮素与化合物18芹菜素。

2.4 MIC及MBC的测定

由表4结果可知,3种单体蒽醌类化合物对鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值均小于氯仿萃取物和组分1,其中大黄素甲醚的整体抑菌效果最佳,结合表3中3种单体蒽醌类化合物的含量和大黄素对白色念珠菌的抑菌效果弱于氯仿萃取物,证明在氯仿萃取物中发挥主要抑菌效果的化合物可能为大黄素甲醚,并且该物质有广谱抗菌性,但整体性上对革兰氏阳性菌的抑制效果强于革兰氏阴性菌,尤其对金黄色葡萄球菌的抑制效果最佳。3种单体蒽醌类化合物对金黄色葡萄球菌的MIC值均为0.2 g/L,MBC值均为0.39 g/L。

表4 不同物质对3种供试菌的MIC值和MBC值

2.5 讨 论

望江南中主要成分包括总酚、鞣质、萜类、皂苷、甾醇、生物碱、香豆素、类固醇、强心苷类、黄酮类和蒽醌类化合物及其衍生物[30],但黄酮类和蒽醌类及其衍生物占比相对较大。对含蒽醌类物质为主要成分的植物提取液(决明子、大黄、芦荟[31])进行天然抗菌活性研究时发现,3种植物提取液均表现出一定的抑菌效果,其中对大肠杆菌、产气杆菌、金黄色葡萄球菌等甚至有强抑制效果。蒽醌类物质的基本母核为蒽醌,也就是9,10-蒽醌结构,其常常在左右两侧苯环增加取代基(如甲基、酚羟基)或是与糖基结合为糖苷类化合物等[32]。蒽醌类物质[33-34]普遍具有抑菌效果的原因可能是源于其母核结构[35],主要机制可能是通过破坏细胞膜和细胞壁的完整性,来抑制细菌的活性。望江南作为决明属植物,而目前对决明属植物的研究主要集中在决明子和铁刀木这2种植物上。对望江南的研究较少,并且对活性的研究主要集中在粗提物的层次,对单体化合物的分析较少,本研究通过抑菌活性这一切入点初步分析筛选出其中发挥抑菌作用的主要化合物,对望江南植物的研究和开发提供了试验依据。

3 结 论

3.1以望江南茎为原料,经超声波乙醇提取后,通过不同极性溶剂萃取得到4种萃取物,采用滤纸片扩散法来初步确定不同极性物质的抑菌活性,发现氯仿萃取物的综合抑菌效果最佳;进一步通过柱层析法对氯仿萃取物进行分离纯化,得到组分1、组分2和组分3,发现极性较低的组分1的抑菌效果整体要强于组分2和组分3的抑菌效果,这是因为氯仿萃取物中极性较小的成分发挥了主要抑菌作用;最后通过LC-MS方法对组分1进行分析,分离得到22个化合物,其中黄酮类7个、蒽醌类13个、多酚类1个、香豆素类1个。

3.2对3种单体蒽醌类化合物的MIC值和MBC值进行了测定,结果发现:大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值均小于氯仿萃取物,其中对金黄色葡萄球菌的抑制活性最强,MIC值均为0.2 g/L,MBC值均为0.39 g/L。3种单体蒽醌类化合物中大黄素甲醚的抑菌效果最佳,推测该物质可能为望江南中发挥抑菌活性的主要化合物之一,大黄素甲醚作为一种蒽醌类化合物,具有天然抑菌试剂开发的潜力。