武都地区初榨橄榄油酚类和脂肪酸组成对油脂氧化稳定性研究

唐凤霞, 李 川, 周 昊, 陈虹霞, 张昌伟, 王成章

(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心;江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210042)

初榨橄榄油作为一种优质的脂质来源,具有延缓衰老、抗炎和维持肠道健康的功效,受到科学界的广泛研究[1-3]。初榨橄榄油的营养特性和氧化稳定性与其化学组成密切相关。初榨橄榄油由98%可皂化部分和2%不可皂化部分组成,可皂化部分由甘油三酯、磷脂和甾醇酯等脂肪酸衍生物组成,其中油酸为主要脂肪酸(占脂肪酸总量的55%～83%),高含量的油酸可以降低20%～40%的冠心病风险[4]。不可皂化部分包括酚类、色素、甾醇、萜类、生育酚及挥发性物质[5],其中酚类是不可皂化部分含量最高的成分,尤其是裂环烯醚萜类(橄榄裂环烯醚萜、刺激醛、橄榄苦苷苷元、女贞子苷元),在橄榄油的营养价值和感官特性方面发挥着重要作用,是橄榄油中主要的抗氧化成分[6]。这些化学成分的组成状况受品种和种植环境影响,并决定油脂的氧化稳定性。近些年,橄榄油中化学成分与氧化稳定性的关系引起了科研人员的广泛研究[7]。尽管脂肪酸、总酚含量与橄榄油氧化稳定性的相关性得到了分析,但具体单个成分的贡献还需要进一步研究。厘清品种、化学成分及油脂氧化稳定性的关系有助于橄榄油品质提升和贮藏管理。虽然地中海国家对橄榄油中脂肪酸和多酚的组成与含量研究较多,但化学成分的表达受品种、气候环境、栽培方式、加工工艺等多方面因素的影响[8-9]。我国作为非典型地中海气候国家,引种种植油橄榄已有60余年,陇南武都区是油橄榄种植一级适生区,但所产橄榄油化学成分的研究大多集中在脂肪酸、简单酚酸及挥发性化合物,对裂环烯醚萜类成分鲜见报道[10]。因此,本研究对比分析了武都常见的14个品种初榨橄榄油的脂肪酸、酚类含量及氧化稳定性,并基于化学指标建立氧化稳定性预测模型,旨在为地方农业部门筛选品种和贮藏橄榄油的指导工作提供理论基础。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

14个油橄榄品种(白橄榄、恩帕特雷、奇迹、阿斯、中山24、云台14、皮瓜尔、豆果、小苹果、鄂植8、阿尔伯萨拉、科拉蒂、莱星、佛奥)收集于陇南市经济林研究院大堡油橄榄品种示范园,采集时间为2021年10月7日至2021年11月15日,每个品种手工采摘收集成熟度为3的果实约6 kg,采摘12 h内全部榨取完毕。羟基酪醇、酪醇、香兰素、香草酸、咖啡酸、对香豆素、松脂酚、木犀草素、芹菜素、乙酸、没食子酸、橄榄苦苷(纯度≥98%),阿拉丁公司;脂肪酸甲酯混合物,美国Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲醇均为色谱纯;石油醚、甲醇、氢氧化钠、碳酸钠均为分析纯;橄榄裂环烯醚萜、刺激醛(纯度≥98%),由希腊雅典大学Maria课题组提供。

Trace 1300 ISQ气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪、LTQ-Orbitrap XL质谱仪,美国赛默飞世尔公司;Abencor橄榄油提取系统(该系统包括一个锤磨机,配备可交换的筛子,一个融合搅拌机和一个离心机),西班牙MC2 INGENIERIA公司;LC-20AT-DAD型高效液相色谱(HPLC)仪,日本岛津公司;892 Rancimat油脂氧化稳定性测定仪,瑞士万通中国有限公司;UV-1800(PC)紫外分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1初榨橄榄油的提取 根据Miho等[11]提取方法,采用Abencor提取系统提取橄榄油。750 g油橄榄果经碾磨机破碎后形成糊状物,转移糊状物至水浴系统,28 ℃下搅拌60 min,随后移至离心机,3 500 r/min条件下离心2次,每次1 min,收集离心液于量筒中,静置分层,收集上层油相于棕色瓶中,-20 ℃保存,备用。

1.2.2脂肪酸组成与含量的测定 根据闫辉强等[12]描述的方法,采用酯交换法对脂肪酸进行甲酯化,采用脂肪酸甲酯混合物标准品来确定GC-MS条件。GC条件:色谱柱AE-FFAP毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),分流进样,进样量为1 μL,分流比30∶1。柱初温70 ℃保持4 min,以10 ℃/min的速率升至190 ℃,保持8 min,再以4 ℃/min的速率升至250 ℃,保持5 min;载气模式为恒流模式,载气流速1.0 mL/min。MS条件:采用EI电离模式,电离电压为70 eV,传输线温度和离子源温度分别为250和280 ℃。质谱设置为全扫描模式,扫描范围为50～800,溶剂延迟2 min;质谱数据库为NIST 2011版标准质谱检索库。

1.2.3多酚类成分组成与含量的测定 根据Deiana等[8]的方法提取酚类化合物并测定酚类组成与含量(稍作修改)。称取约3 g初榨橄榄油与5 mL 80%甲醇水溶液涡旋混合,置于摇床30 ℃水浴振荡30 min,10 000 r/min离心混合液3 min,收集甲醇/水层移至60 ℃真空干燥至液体挥干,最后用1 mL甲醇定容,过0.22 μm滤膜,得多酚提取物溶液,-20 ℃保存,备用。

采用HPLC-MS确定橄榄苦苷苷元、女贞子苷元、8-乙酰氧基松脂酚的保留时间。HPLC条件如下:色谱柱Nuclosil 100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.2%的乙酸水溶液(A)和乙腈/甲醇(体积比1∶1)(B),流速为1 mL/min,检测波长为280 nm。梯度洗脱程序为:0～40 min,4%～50%B;40～50 min,50%～40%B;50～60 min,100%B;60～70 min,100%～4%B;70～82 min:4%B。MS条件:负离子模式,离子源为ESI源(源加热器温度300 ℃,鞘气流量700 L/h,锥气流量50 L/h,毛细管温度320 ℃,毛细管电压-10 V,离子喷射电压2.9 kV),扫描范围(m/z)100～800。采用外标法基于HPLC对多酚类化合物进行定量分析,橄榄苦苷苷元和女贞子苷元的含量根据橄榄苦苷定量,乙酰氧基松脂酚的含量根据松脂酚定量。

总酚测定采用福林酚法,精密吸取50 μL上述提取物溶液于10 mL试管内,依次加入1 mL 20%现配福林酚试剂、 2.5 mL 0.15 g/mL碳酸钠溶液,涡旋混匀,加水定容至10 mL,室温下避光反应120 min后,采用分光光度计测定750 nm处吸光度,根据标准液没食子酸质量浓度和吸光度绘制标准曲线。

1.2.4油脂氧化稳定性的测定 氧化稳定性测定参照Miho等[11]方法,通过油脂氧化稳定性测定仪进行,取3.0 g的油样置于试管中,在(120±1.6) ℃下加热,通入空气,气流速度20 L/h,记录结果,以诱导时间(t)表示。

1.3 数据处理与统计分析

利用Microsoft excel汇总处理数据,采用Simca-P14.0软件进行主成分分析。单因素试验方差分析和逐步回归分析采用SPSSAU在线软件(https:∥spssau.com/)处理,结果以“平均值±标准差”表示,差异显著性水平小于5%(p<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 脂肪酸的组成与含量

14个品种初榨橄榄油的主要脂肪酸组成与含量见表1。由表1可知,所有样品均符合欧盟特级初榨橄榄油标准[13]。品种间脂肪酸组成相似但含量存在显著差异(p<0.05),表明脂肪酸是区分品种非常有用的参数。主要脂肪酸分成单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱脂肪酸(PUFA)和饱和脂肪酸(SFA)3大类,初榨橄榄油中油酸、亚油酸、棕榈酸依次为3大类中含量最高的脂肪酸。油酸质量分数在56.12%(豆果)和71.45%(科拉蒂)之间,亚油酸质量分数在5.73%(皮瓜尔)和15.80%(阿斯)之间,棕榈酸质量分数在12.67%(科拉蒂)和18.76%(豆果)之间。中山24是阿斯的改良品种,与原品种阿斯相比,改良品种中山24油酸和棕榈酸的含量均更高。MUFA/PUFA的比值是鉴别品种和评估油脂氧化稳定性的重要指标,如表2所示,14个品种初榨橄榄油的MUFA/PUFA的比值从最低的阿斯为3.59到最高的皮瓜尔为11.04。与地中海国家所产橄榄油相比,武都所产橄榄油呈现出低油酸和高亚油酸含量的特征,这些结果与Gao等[14]结果一致,主要原因可能是武都的气温低于同期的地中海国家,而低温有利于多不饱和脂肪酸的合成以提高细胞膜的流动性[15]。

表2 14个品种初榨橄榄油中不同饱和度脂肪酸的分布情况1)

2.2 多酚化合物的组成与含量

13种酚类物质的质谱图(图1)和定性分析结果见表3,具体含量分析结果见表4和表5。品种对所有酚类化合物含量均具有显著影响(p<0.05)。橄榄油中酚类化合物主要分为裂环烯醚萜、黄酮、酚醇、酚酸、木脂素5大类,其中裂环烯醚萜类是橄榄油中含量最高的酚类物质。在橄榄油生产第一阶段,内源性的β-糖苷酶催化油橄榄果实中的橄榄苦苷与女贞子水解生成橄榄苦苷苷元和女贞子苷元,随后经内源性甲基酯酶催化,快速脱羧产生橄榄裂环烯醚萜和刺激醛[16]。刺激醛与布洛芬化学结构相似,被认为是一种天然甾醇类药物,且具有抗炎、抗衰老的功效,是橄榄油辛辣味的主要来源,而橄榄裂环烯醚萜是橄榄油苦味的主要来源[6]。武都所产橄榄油中裂环烯醚萜类化合物组成与地中海国家橄榄油一致,但是含量与其他文献报道数据存在差异,这些差异可以用作物季节、农艺管理和气候条件等其他外部因素来解释[9]。橄榄裂环烯醚萜的质量分数在43.89 mg/kg(豆果)和205.90 mg/kg(奇迹)之间,刺激醛的质量分数在25.65 mg/kg(鄂植8)和123.41 mg/kg(中山24)之间,说明奇迹和中山24是生产高阈值苦味和辛辣味初榨橄榄油的优势品种。橄榄苦苷苷元的质量分数在12.91 mg/kg(豆果)到98.38 mg/kg(科拉蒂)之间,女贞子苷元的质量分数在12.17 mg/kg(阿尔伯萨拉)到33.81 mg/kg(奇迹)之间。可以看出,裂环烯醚萜类化合物含量为奇迹最高,而豆果最低。

图1 中山24初榨橄榄油80%甲醇提取物的质谱Fig.1 Mass spectrogram of 80% methanol extract of Zhongshan24 virgin olive oils

表3 13种主要酚类化合物的质谱信息

表4 初榨橄榄油中裂环烯醚萜类和黄酮类化合物组成与含量

表5 初榨橄榄油酚醇类、酚酸类、木脂素化合物组成与含量

木脂素类是橄榄油中质量分数第2高的酚类物质,阿斯和改良品种中山24都含有较高的木脂素,分别为25.98和22.53 mg/kg,展现了品种的同源性。根据欧洲食品安全局(EFSA)对橄榄油多酚的健康声明,每20 g橄榄油中至少需含有5 mg的羟基酪醇及其衍生物(如橄榄苦苷复合物和酪醇)[17]。阿斯含有最高的羟基酪醇和酪醇,分别为3.21和12.32 mg/kg。关于黄酮类,科拉蒂的芹菜素质量分数最高,为6.62 mg/kg,阿尔伯萨拉的木犀草素质量分数最高,为2.81 mg/kg。酚酸类化合物中香草酸、咖啡酸、香兰素、对香豆酸的质量分数最高依次为4.67 mg/kg(云台14)、 3.03 mg/kg(豆果)、 2.59 mg/kg(云台14)和3.47 mg/kg(小苹果)。对于总酚的分布,奇迹的总酚质量分数最高,为471.35 mg/kg,而豆果中总酚最低,为165.65 mg/kg,这与橄榄油中裂环烯醚萜含量密切相关。低含量的酚类成分影响橄榄油的品质,不利于橄榄油的保存。值得注意的是,与原品种阿斯相比,改良品种中山24的总酚含量增加了60.39%,表明改良育种对橄榄油中酚类化合物的提升具有积极的作用,对于鄂植8、豆果、佛奥等酚类含量较低的品种改良具有指导意义。

2.3 油脂氧化稳定性的分析

采用Rancimat法测试14个品种42个油样的氧化稳定性,诱导时间越长,表明油脂氧化稳定性越高,结果见表6。由表可知,品种对油脂氧化稳定性具有显著影响(p<0.05),诱导时间在39.93 h(奇迹)与7.11 h(豆果)之间,平均值19.29 h,变异系数为46.32%。14个品种中50%的品种诱导时间在10～20 h,21.43%的品种诱导时间在20～30 h。科拉蒂和奇迹具有更高的氧化稳定性,诱导时间在30 h以上,而豆果和阿斯的氧化稳定性较低,诱导时间在10 h以下,结果与之前研究一致[18]。改良品种中山24的氧化稳定性是原品种阿斯的2.93倍。

表6 14个品种初榨橄榄油油脂氧化稳定性

然而,阿斯的总酚含量与皮瓜尔、阿尔伯萨拉、鄂植8相近,但具有不同的氧化稳定性。奇迹与莱星脂肪酸组成相似,但氧化稳定性存在差异。为揭示氧化稳定性、化学成分以及品种之间的相关性,对数据集进行主成分分析。根据交叉验证,前3个主成分可以解释63.2%的变异性(表7)。图2(a)为橄榄油组分与抗氧化活性指标关系的载荷图,图中显示氧化稳定性与橄榄苦苷苷元、女贞子苷元、芹菜素、油酸、橄榄裂环烯醚萜的含量呈正相关,与之前的研究一致。相反,氧化稳定性与刺激醛、酪醇、羟基酪醇、亚油酸、棕榈酸的含量呈负相关,其中羟基酪醇的负相关与Mateos等[19]报道不一致,主要因为Mateos讨论的是单个化合物在油脂中的抗氧化行为,而实际抗氧化行为发生在复合体系中,酚类化合物的抗氧化效应受分子间相互作用影响,可能产生相反的抗氧化行为,Miho等[11]的研究也得到了相似的结果。显然,油脂的氧化稳定性与具体化学成分相关。根据化学成分分布,品种可以被分成3类(图2(b)),第1组样品(红色标记)氧化稳定性较高,有较高含量的橄榄苦苷苷元、女贞子苷元、橄榄裂环烯醚萜、油酸;第2组样品(蓝色标记)氧化稳定性较低,富含棕榈酸、亚油酸、酪醇、羟基酪醇;第3组样品(绿色标记)诱导时间在10～30 h之间,代表了陇南地区橄榄油氧化稳定性71.43%的水平。

TPP:总酚含量 total phenolic content; IT:诱导时间 induction time

表7 PCA特征值及方差贡献率

2.4 多元线性回归建立油脂氧化稳定性预测模型

表8 线性回归分析结果(n=42)

3 结 论

3.1对武都种植的14个常见品种初榨橄榄油的化学成分和油脂氧化稳定性进行分析,结果表明:武都橄榄油的脂肪酸和多酚组成与地中海地区的橄榄油一致,品种间多酚和脂肪酸含量及油脂氧化稳定性存在显著性差异(p<0.05)。与地中海地区相比,武都初榨橄榄油的油酸含量略低,亚油酸含量略高,但均符合特级初榨橄榄油的脂肪酸标准。油酸质量分数在(56.12±0.24)%(豆果)与(71.45±0.42)%(科拉蒂)之间,亚油酸质量分数在(5.73±0.06)%(皮瓜尔)与(15.80±0.05)%(阿斯)之间。总酚的质量分数在(165.65±8.08)mg/kg(豆果)和(471.35±29.34)mg/kg(奇迹)之间。奇迹和科拉蒂的氧化稳定性最高,豆果和阿斯的氧化稳定性最低。该研究结果为不同功能价值和风味特性的初榨橄榄油的生产提供了参考。

3.2主成分分析表明橄榄苦苷苷元、女贞子苷元、芹菜素、油酸、橄榄裂环烯醚萜可以提高油脂氧化稳定性,而刺激醛、酪醇、羟基酪醇、亚油酸、棕榈酸会降低油脂氧化稳定性。基于逐步线性回归分析,建立了以芹菜素、橄榄裂环烯醚萜、木犀草素和亚油酸为解释变量的回归模型,该模型可以预测初榨橄榄油的氧化稳定性,为橄榄油保质期的预测提供了一定的理论基础。