银杏硫酸盐木质素组分分离及其抗肿瘤构效研究

谢益民, 岳园园, 赵云博, 魏 鑫

(1.湖北工业大学 制浆造纸研究院,湖北 武汉 430068; 2.湖北工业大学 绿色轻工材料湖北省重点实验室,湖北 武汉 430068)

全球癌症患者中肺癌的死亡率最高,每年约有180万肺癌患者死亡,占癌症死亡总人数的18%[1-2]。化疗是目前用于对抗癌症的常见治疗方法,然而,现有的肺癌化疗药物普遍存在生物利用度低、水溶性差、治疗指数低、剂量要求高和靶向性差等局限性[3],在杀死癌细胞的同时对人体自身也造成了很大的伤害,因此人们一直致力于天然药物在抗癌上的应用。木质素已被证实具有一定的抗肿瘤活性,Lu等[4]发现碱处理的木质素可抑制2种自由基相关酶黄嘌呤氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的活性,是一种超氧阴离子和羟基自由基清除剂,同时发现碱木质素可阻碍酶和非酶系统中的脂质过氧化以及宫颈癌HeLa S3细胞的生长。Lbaj等[5]从硫酸盐法制浆废液中分级得到木质素,在小鼠淋巴细胞中测试了木质素的体外抗肿瘤活性,与对照组相比,在木质素预孵育的细胞中由H2O2诱导的DNA链损伤明显减少。Geies等[6]采用氢氧化钠-硫酸氢钠法从甜高粱、稻草和甘蔗渣3种不同的农业废弃物中分离木质素,发现所有木质素样品均对肺癌A549细胞具有较高的细胞毒性潜力。叶哲孜等[7-8]合成了低相对分子质量的木质素模型物(DHP),在对DHP的生理活性研究中发现苯环上的甲氧基、侧链上的羧基会降低木质素的抗肿瘤性能,β-O-4连接对抗肿瘤活性无影响,β-5连接的苯基香豆满结构抗癌效果明显。Xie等[9]合成了G型和GS型低分子木质素模型物,发现β-5连接的二聚体、三聚体能够抑制宫颈癌HeLa细胞的生长,而β-O-4连接对抗肿瘤活性无贡献。与合成的抗癌化疗药物相比,木质素还具有很好的生物相容性,Sakagami等[10]发现向小鼠经口给药带标记的天然木质素和合成木质素后,会通过消化道吸收并通过尿液和粪便排出,不会残留在体内。Ugartondo等[11]发现甘蔗渣木质素在一定浓度范围内具有很高的抗氧化能力,并且对正常人体细胞无害。Barapatre等[12]从尼罗相思木材中提取不同的木质素组分,发现对人体乳腺癌MCF-7细胞具有较高的细胞毒性潜力(IC50值为2～15 mg/L)。与多糖基材料相比,木质素尚未在生物医学领域得到广泛开发应用[13],并且由于木质素的结构比较复杂,有关木质素抗癌活性的根源还缺乏系统的解析。对于工业木质素中生理活性较高的低聚物(苯丙烷结构单元在10以下)的分离提纯和抗癌性能方面尚缺乏系统性的研究。因此,本研究在分离提取银杏硫酸盐木质素中低聚物的基础上,一方面探索木质素对于肺癌A549的抗肿瘤活性,另一方面分析其化学结构,阐释木质素生物活性的构效关系,以期为木质素的高附加值利用拓宽方向。

1 实 验

1.1 原料、试剂及仪器

6年生银杏(GinkgobilobaL.),武汉江夏苗圃;人源肺癌A549细胞,北京北纳生物科技有限公司;硫化钠、盐酸、溴化钾、正己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氧六环、丙酮,国药化学试剂公司;PBS缓冲液,德国Hyclone公司;RPMI 1640基础培养基、青霉素-链霉素混合液,美国Gibco公司;胎牛血清(FBS),浙江天杭生物科技有限公司;噻唑蓝(MTT),北京兰杰柯科技有限公司;胰蛋白酶,北京索莱宝公司;药用级吐温-80,上海麦克林公司;DLM-10tc DMSO-d6,美国CIL公司。

T25细胞培养瓶;4-16K冷冻离心机;圆盘削片机;6700型红外光谱(FT-IR)仪,美国Thermo Fisher Nicolet公司;YM50立式压力蒸汽灭菌锅,上海三申医疗器械有限公司;HPLC-20AT高效液相色谱(HPLC)仪,日本Shimadzu公司;NanoQuant Infinite M200pro酶标仪,瑞士TECAN公司;UV 230Ⅱ型紫外可见检测器,大连依利特分析仪器公司;C-615中压液相制备色谱、BOROSILIKAT 3.3 CODE NO.17982和NO.28139分离柱,瑞士Buchi公司;XDS-1E倒置生物显微镜,上海比目仪器有限公司;Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(75～150 μm),上海如吉生物科技有限公司。

1.2 银杏硫酸盐木质素(KL)与银杏磨木木质素(MWL)的提取及表征

1.2.1KL的提取 利用圆盘削片机将银杏木材削片,取1 kg银杏木片(以绝干计),采用硫酸盐法制浆对银杏木片进行蒸煮,硫化度27%,用碱量(以Na2O计)20%,固液比1∶5(g∶mL),蒸煮完成后过滤出制浆黑液,磁力搅拌条件下用体积分数10%的盐酸逐滴酸化黑液至pH值为2左右,期间将黑液保持温度为55 ℃左右,静置分层1 h后过滤,用含HCl的pH值为3的酸性水洗涤多次,真空干燥得到KL。

1.2.2MWL的提取 银杏木片风干处理后,用植物研磨粉粹机粉碎,取粒径为0.42～0.63 mm的木粉,苯醇抽提6～8 h,真空干燥2周后,经水冷式振动球磨机球磨72 h,按照Björkman[14]方法提取得到MWL。

1.2.3FT-IR分析 木质素红外光谱制样采用溴化钾压片法,取2 mg木质素样品与100 mg无水KBr在玛瑙研钵中混合均匀,将其充分研磨后均匀地平铺在压片模具内,在18 MPa压力下压片2.5 min,采用红外光谱仪检测样品在4 000～500 cm-1波数范围内的红外光谱图,分辨率为2 cm-1。

1.3 KL的分级及产物表征

1.3.1KL的分级 将KL用滤纸包好后放入索氏抽提器,用正己烷抽提6 h,将抽出物减压蒸干后得到组分LC1。再用乙醚对残渣进行抽提,得到组分LC2。依次用乙酸乙酯、二氧六环对残渣继续进行抽提,分别得到组分LC3和LC4。

1.3.2相对分子质量的测定 各分级组分的相对分子质量通过体积排阻色谱法测定。以EasiVial PS-M为标准品,绘制相对分子质量标准曲线。将1 mg分级组分溶于1 mL色谱纯的DMF中,通过0.22 μm微孔滤膜过滤,然后注入HPLC仪测定相对分子质量。具体的仪器参数为Styrage HR 4E色谱柱(300 mm×7.8 mm),Styrage保护柱(30 mm×4.6 mm),RID-10A示差折光检测器,流动相为DMF(含0.1 mol/L的LiCl),流速1.0 mL/min,柱温50 ℃,进样量20 μL。

1.3.3总酚含量(TPC)的测定 各分级组分的总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu比色法[15]。首先配制125～1 000 mg/L质量浓度梯度的没食子酸甲醇溶液,取100 μL标准溶液,加入500 μL Folin-Ciocalteu试剂和6 mL蒸馏水后充分振荡1 min,在0.5～8 min内加入2 mL 15% Na2CO3溶液,再次振荡0.5 min,最后补充蒸馏水至10 mL。室温避光静置2 h后用紫外可见分光光度计测定760 nm(25℃)下的吸光度,绘制没食子酸质量浓度与吸光度的标准曲线。按照相同的方法测定所有样品溶液还原Folin-Ciocalteu试剂后在760 nm(25 ℃)下的吸光度,每个数据点重复测量3次,控制吸光度在0.2～0.7之间,根据没食子酸标准曲线拟合的结果,按照式(1)计算样品的总酚质量分数(wTPC):

wTPC=C×V×N/m×100%

(1)

式中:C—从标准曲线中计算得到的没食子酸质量浓度,g/L;V—分级组分的最终体积,mL;N—稀释倍数;m—样品质量,g。

1.3.4抗肿瘤活性的测定 胰蛋白酶处理对数生长期细胞,计数后稀释成细胞悬液(5×104个/mL),在培养箱(37 ℃,5% CO2)中培养16～48 h,培养瓶底层细胞贴壁后,实验组加入100 μL不同质量浓度(12.5～800 mg/L)的各分级组分样品,样品用1 mL CM2-1完全培养液溶解(脂溶性样品先加入适量的甲醇或丙酮等有机溶剂和0.5%吐温-80,再补加CM2-1完全培养液至1 mL,稀释至不同的质量浓度),在细胞培养箱(37℃,5% CO2)中培养48 h后每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L),培养4 h后弃去上清液,每孔中加入150 μL DMSO,放入酶标仪中低速摇晃10 min,在490 nm下测定每孔的吸光度(A)。其中,空白组不加入细胞和样品,对照组不加入样品,分别加入与实验组相同质量浓度的溶剂和完全培养基,培养和测定方法同上。细胞生长抑制率(η)按式(2)计算,以样品质量浓度为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制不同组分样品对肺癌A549细胞增殖的抑制率曲线,并用SPSS26软件拟合计算半数抑制质量浓度(IC50)[16-17]。

η=(A对照-A实验)/(A对照-A空白)×100%

(2)

1.4 KL乙醚可溶组分(LC2)的分离纯化及表征

1.4.1LC2的纯化 利用中压液相制备色谱对银杏硫酸盐木质素的乙醚抽提物LC2进行梯度洗脱纯化。固定相为Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(75～150 μm),流动相为氯仿-甲醇混合洗脱液,流速2.5 mL/min,紫外检测器波长280 nm,用20 mL定量环湿法进样。

具体操作为:先将LC2样品用丙酮溶解,用氯仿-甲醇(50%∶50%)冲洗分离柱,进样后逐渐增加甲醇的体积分数,最后用甲醇完全冲洗分离柱,在分离过程中用紫外可见检测器检测物质出峰情况。LC2经纯化后依次得到L1、L2、L3、L4、L5、L6和L7等7个化合物,得率分别为30.38%、23.13%、20.68%、12.80%、6.33%、5.14%和1.54%。

1.4.2HESI-MS分析 通过静电场轨道肼质谱获取L7的质谱信息。该离子源为HESI源,干燥气体N2,雾化气压力4 MPa,辅助气压力0.8 MPa,喷雾电压3 200 V,离子传输毛细管温度300 ℃,辅助气温度280 ℃,扫描方式为负离子Full MS/dd-MS2,扫描范围(m/z)为50～750。

1.4.313C NMR分析 将20 mg化合物L7溶解在0.6 mL DMSO-d6中,并放入5 mm核磁测试管中,用NMR波谱仪在150.91 Hz下扫描获得相应的13C NMR波谱。测试温度25℃,脉冲延迟2.0 s,采集时间0.69 s,扫描次数3 000次。

2 结果与讨论

2.1 分级组分的结构表征

图1 MWL、KL及分级组分的FT-IR

2.1.2相对分子质量测定 银杏硫酸盐木质素各分级组分的相对分子质量见表1。由表1可知,随着溶剂极性和溶解能力的增大,分级组分的相对分子质量也逐渐增加,LC1～LC4的Mw在700～4 800之间,并且组分LC1、LC2和LC3的多分散系数(PDI)较小,表明利用不同有机溶剂对其进行分级的效果比较好。

表1 各分级组分的相对分子质量和总酚质量分数

2.1.3总酚含量(TPC)分析 经过拟合得到760 nm处没食子酸的标准曲线方程为y=0.958x+0.074,R2=0.981。经计算各分级组分相对于没食子酸的总酚含量见表1。从表1可以明显看出,各分级组分的总酚含量都随着相对分子质量增大而降低,正己烷可溶组分(LC1)和乙醚可溶组分(LC2)的总酚含量较高。在硫酸盐法制浆过程中,木质素的结构发生了显著的变化,由于β-芳基醚键的断裂,硫酸盐木质素中游离酚羟基的含量显著提高。

2.2 抗肿瘤活性分析

2.2.1分级组分的抗肿瘤活性 银杏硫酸盐木质素分级组分对肺癌A549细胞抑制率结果如图2(a)所示,其中LC1、LC2、LC3和LC4的IC50值分别为(695.93±9.24)、(366.09±6.39)、(1 366.18±21.90)和(1 605.61±37.93) mg/L。可以明显看出,各分级组分对于肺癌A549细胞均有不同程度的抑制作用,并且抑制率与质量浓度大致呈对数函数关系。与其他分级组分相比,乙醚可溶组分(LC2)对肺癌A549细胞的抑制效果最好,IC50值最小。

图2 分级组分(a)和纯化物质(b)对肺癌A549细胞的抑制率

2.2.2LC2组分纯化物质的抗肿瘤活性 LC2组分纯化物质对肺癌A549细胞抑制率结果如图2(b)所示,其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7的IC50值分别为(446.23±8.03)、(339.74±8.78)、(303.76±7.31)、(188.01±4.66)、(175.86±4.35)、(159.61±3.75)和(89.44±2.13) mg/L。结果表明:各纯化物质对于肺癌A549细胞均有不同程度的抑制作用,并且抑制率与质量浓度大致呈对数关系。与银杏硫酸盐木质素分级组分相比,纯化物质对肺癌A549细胞的抑制效果显著增强,这表明经过中压液相制备色谱的纯化,能成功分离出木质素分级组分中的生物活性物质。在所有样品中,对肺癌A549细胞的抑制效果较好的是L7,其IC50值为(89.44±2.13) mg/L。根据美国国家癌症研究所[19-20]和Geran方案[21]的标准,IC50≤20 mg/L为高度细胞毒性,IC50介于21～200 mg/L为中度细胞毒性,IC50介于201～500 mg/L 为弱细胞毒性,以及IC50>501 mg/L 为无细胞毒性。上述结果表明:L1～L3对肺癌细胞具有弱细胞毒性,L4～L7具有中度细胞毒性,因此对L7进行进一步研究。

2.3 纯化物质L7的结构表征

2.3.1HESI-MS分析 纯化物质L7的质谱信息如图3所示。m/z409.096处为L7的分子离子峰,L7的分子结构式应为C23H22O7。丰度最高为m/z149.061处,来源于香豆满结构断裂后产生的碎片峰,证明了G型木质素中苯丙烷单体侧链上的C-γ与其他位置相比是不稳定的,易发生断裂。m/z137.061为m/z149.060处C-β进一步断裂形成的碎片峰。m/z177.055处为松柏醛单体的离子信号峰。m/z353.103处为β-5结构的松柏醛二聚体(β-5,γ-CHO,γ’-CHO)的离子信号峰,m/z409.096处与m/z353.103相差56,表明m/z409.096处为酚羟基上连有2-丙醛取代基的β-5结构的松柏醛二聚体,结合m/z381.134和395.113处为m/z409.096处的进一步断裂,证实了m/z409.096处的结构如图4所示。

图3 纯化物质L7的质谱

银杏硫酸盐木质素是在天然木质素的基础上获取的,醛基是天然木质素中常见的结构,但是天然木质素中酚羟基上连有2-丙醛取代基的β-5结构的松柏醛二聚体比较少见,前人也有类似的发现[22-23]。在硫酸盐法制浆过程中,由于木质素受碱性氧化,醛基的含量有显著提高。

2.3.213C NMR分析 来自银杏硫酸盐木质素的纯化物质L7的13C NMR谱图如图4所示,主要共振信号有:δ199.74(C-10),193.07(C-γ),192.00(C-γ’),152.71(C-α’),149.15(C-3),148.05(C-4),147.91(C-4’),145.13(C-3’),133.39(C-1),129.81(C-1’),129.39(C-5’),127.02(C-β’),121.15(C-6),120.61(C-6’),115.56(C-5),115.42(C-2’),111.73(C-2),88.11(C-α),79.80(C-8),58.65(C-β),56.50(C-7),56.07(C-7’),40.07(DMSO),15.31(C-9)。

以上结果表明L7为酚羟基上连接着2-丙醛取代基的β-5结构的松柏醛二聚体。

2.4 纯化物质的构效关系讨论

HESI-MS和13C NMR的结果表明,L7为酚羟基上连接着2-丙醛取代基的β-5结构的松柏醛二聚体,与前人的工作相比这类化合物的抗肿瘤活性在一定程度上有所降低,这可能受苯丙烷结构上醚键的影响,这与前人的研究结果一致[22]。

Zemek等[24]研究了木质素模型物的生物活性,发现在苯环侧链上含有Cα=Cβ,并且Cγ上含有甲基的模型物效果最好,然而,侧链上羟基、羰基和羧基的增加都会降低生物活性。叶哲孜等[23]以异丁香酚为原料合成木质素脱氢聚合物(DHP),发现苯丙烷结构侧链上醛基的增加会削弱DHP的抗氧化性和抗菌性,而本研究表明L7在侧链上含有醛基,具有较好的抗肿瘤活性。这也可能是由于前人研究的物质没有分离到单分子水平,杂质造成的误差比较大;另外前人用的木质素原料相对分子质量较大,空间位阻较强,导致醛基生物活性被一定程度的屏蔽。

3 结 论

3.1银杏木片经硫酸盐法制浆得到硫酸盐木质素(KL),FT-IR的分析结果表明KL和银杏磨木木质素(MWL)在结构上比较相似,均属于G型木质素。

3.2银杏硫酸盐木质素用不同极性溶剂分级,得到正己烷可溶组分(LC1)、乙醚可溶组分(LC2)、乙酸乙酯可溶组分(LC3)和二氧六环可溶组分(LC4)。生物活性实验表明:在上述组分中,乙醚可溶组分(LC2)对肺癌A549细胞的抑制作用最强,IC50值为(366.09±6.39) mg/L。

3.3用中压液相色谱对组分LC2进一步分离纯化,得到L1～L7这7个化合物。其中化合物L7的抗肿瘤活性最好,对肺癌A549细胞的IC50值为(89.44±2.13) mg/L。HESI-MS测定结果发现L7是酚羟基上连接着2-丙醛取代基的β-5结构的松柏醛二聚体。13C NMR的分析结果进一步证实了化合物L7的结构。通过分析化合物L7的结构和抗肿瘤活性的构效关系,发现木质素中小分子物质的苯丙烷结构单元侧链上醛基的增加会提高其抗癌活性,但是醚键的增加会降低其抗癌活性。