长期中度干旱下3 种苹果砧木水分利用效率评价

李晓涵，刘怡童，胡 玮，李中勇，周莎莎

（河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071000）

苹果（Malus pumila）在我国种植历史悠久，产区分布范围广泛，产量居世界首位。河北省作为中国苹果主产区和优势区之一，位于我国华北平原中北部，属温带大陆性季风气候，雨热同期，深受旱涝灾害的影响［1-3］。程雪等［4］在对北方苹果主产区各等级干旱的时空分布特征的研究中发现，河北省在1981—2016 年内为重旱区。王莺等［5］研究表明河北具有较高的水资源脆弱性，其主要体现在地表水资源密度较低。同时，有大量研究表明，干旱胁迫已经成为制约苹果生产的主要因素之一［6-7］。干旱胁迫作为最重要的非生物胁迫之一，会对植物的生长形态结构和生理生化反应产生不利影响, 比如抑制植物生长，减弱叶片光合强度，增加细胞内活性氧含量，影响植物体内抗氧化酶活性和渗透调节物质合成等，严重时还会导致植物死亡［8］。王会肖等［9］研究表明高水平的水分利用效率（WUE）是在半干旱、干旱地区进行可持续作物生产的关键。因此，提高长期干旱胁迫下苹果植株的WUE 是提高河北省苹果生产效益的重要途径之一。WUE 是指单位水分供给条件下植物生物量的增长幅度, 是对植物性能的一种测量。目前从叶片、植株个体、林分和群落3 个水平上对WUE 进行描述。叶片水平的 WUE 一般是指叶片光合速率与蒸腾速率的比值；植株个体水平的WUE 是指单位耗水量内个体生物量的增加量；林分或群落水平的WUE 一般是指特定区域内的光合净同化量与蒸腾量的比值［10］。由于植物WUE 是一个可遗传性状，且砧木对于苹果的水分吸收和树体生长具有重要作用，所以通过选育高WUE 的砧木，并在其上嫁接优良品种，是提高植物WUE 的有效途径［11］。

本试验以嫁接在平邑甜茶（Malus hupehensis var.mengshanensis）上的河北农业大学苹果砧木创新团队培育的2 种砧木‘13#30’和‘10-1’以及‘M9’的1 年生盆栽苗作为研究对象。其中，砧木‘13#30’为‘鸡冠’בSH40’的杂交后代，砧木‘10-1’为‘SH40’的实生后代。对3 种砧木进行正常供水和长期中度干旱处理，测定3 种苹果砧木的WUE和相关形态生理指标，并对上述指标进行相关性分析，筛选出与WUE 相关性较强的生理指标。以期了解3 种不同苹果砧木在长期中度干旱胁迫下产生WUE 差异的生理机制，为评价苹果WUE 筛选相关性强的生理指标，以及为WUE 评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

本试验地点位于河北农业大学三分厂塑料大棚内。于2022 年3 月4 日，将1 年生平邑甜茶种植于黏土∶细沙∶牛粪配比为3∶1∶1 的塑料花盆（盆口直径30 cm，盆底直径20 cm，盆高22 cm）中，并进行常规管理。于2022 年3 月21 日，将‘13#30’‘M9’和‘10-1’3 种苹果砧木芽接至平邑甜茶上，每种砧木嫁接60 株，并进行常规管理至6 月24 日。于2022 年6 月25 日（处理0 d），从每种砧木中选取生长一致的植株50 株，并分为正常供水（保持土壤相对含水量75%～85%，CK）和长期中度干旱胁迫（保持土壤相对含水量45%～55%，D）2 组处理，每组25 株，处理时间为60 d。本试验采用称重法控制土壤相对含水量，于隔天早上8 点进行称重和灌溉，并记录下每种砧木每个处理植株的平均灌溉量，用于计算总灌溉量。于处理0 d 收集每种砧木中长势一致的植株10 株，并测定植株干物质量。于处理60 d，测量每种砧木每个处理植株的形态指标、植株干物质量、光合色素含量、光合参数以及叶绿素荧光参数，每个处理重复10 次。分别于处理0、20、40 和60 d，采集每种砧木干旱胁迫处理植株的中上部功能叶片进行其他相关生理指标测定，重复10 次。

1.2 测量指标与方法

1.2.1 形态指标测定 于处理60 d，选取每种砧木每个处理生长一致的植株10 株，先用钢卷尺和游标卡尺分别测量接穗高度（从嫁接口至顶芽的长度），基砧直径（嫁接口下方2 cm 处）和接穗直径（嫁接口上方2 cm 处）；然后将植株拔出、洗净并分为根、茎和叶3 部分，首先使用便携式叶面积仪LI-3000C（LI Cor, USA）测量叶片总面积，之后将根、茎和叶于105 ℃烘箱内杀青20 min 并于80 ℃烘箱内烘干至恒重后称重。比叶重为叶片干重与叶片面积的比值，根冠比为根干重与地上部干重的比值［12］。

1.2.2 相对电导率和光合色素含量的测定 参考赵琪［13］和何晓龙等［14］的方法使用雷磁 DDS-307 电导率仪测定不同苹果砧木叶片的相对电导率。

参考何家乐［10］的方法，测定不同苹果砧木叶片的光合色素含量。并利用下面公式先计算出叶绿素a（Ca）、叶绿素b（Cb）、总叶绿素（CT）和类胡萝卜素（Car）的质量浓度（mg/L），再计算出光合色素含量（mg/g）。

Ca=12.72×OD663-2.59×OD645

Cb=22.88×OD645-4.67×OD663

CT=Ca+Cb=8.05×OD663-20.29×OD645

Car= (1 000×OD470-3.27×Ca-104×Cb)/229

光合色素含量=(C×V)/(m×1 000)

公式中，C为光合色素的质量浓度，V为浸提试剂体积（mL），m为样品鲜质量（g），1 000 为将提取液体积换算（L）。

1.2.3 光合参数和叶绿素荧光参数的测定 于晴天上午9:00-11:00，使用LI-6400 型便携式光合仪测定每种砧木每个处理中成熟完整的植株中上部功能叶片的净光合速率（Pn）和蒸腾速率（Tr），并通过公式计算出叶片的瞬时水分利用效率（WUEi=Pn/Tr），光强设置为800 μmol/(m2·s)，CO2浓度设置为400 μmol/mol，环境温度设置为25 ℃。参照赵文哲等［15］的方法，使用pocket PEA 手持叶绿素荧光仪测定每种砧木每个处理的叶片初始荧光（F0）和光系统Ⅱ（PSⅡ）最大光化学效率（Fv/Fm）。

1.2.4 丙二醛含量和抗氧化酶活性的测定 丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）活性，过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性的测定分别采用硫代巴比妥酸法、氮蓝四唑（NBT）法、愈创木酚法和紫外吸收法［16］。

1.2.5 渗透调节物质含量的测定 脯氨酸（Pro）含量和可溶性蛋白含量（SPC）的测定分别采用茚三酮比色法和考马斯亮蓝(G-250)法［17］。

1.2.6 长期水分利用效率的测定 长期水分利用效率（WUEL）由试验期间植株干物质增加量与总灌溉量之比得到。本试验参照刘丙花［18］的方法对WUEL进行测定。

1.3 数据统计分析

使用Microsoft Excel 2021 对数据进行统计整理，R 语言软件进行相关性分析，软件DPS 9.01 对数据进行方差分析，软件Origin 2021 作图。

2 结果与分析

2.1 不同苹果砧木在长期中度干旱胁迫下的形态指标的差异

由表1 所示，与其对照组相比，干旱胁迫显著抑制了3 种苹果砧木的地上部生长，主要表现在接穗高度、接穗直径、基砧直径和总叶面积上，而比叶重的变化不存在一定的规律性。其中，干旱胁迫下，砧木‘13#30’总叶面积的下降幅度低于砧木‘M9’和砧木‘10-1’，且其比叶重显著减少；砧木‘M9’接穗高度、接穗直径和基砧直径的下降幅度低于砧木‘13#30’和砧木‘10-1’，且其比叶重显著增加；砧木‘10-1’接穗直径和总叶面积的下降幅度高于砧木‘13#30’和砧木‘M9’，且其比叶重无显著差异。同时，与其对照组相比，干旱胁迫也显著促进了3 种苹果砧木的根冠比。其中，砧木‘13#30’根冠比的上升幅度低于另外2 种砧木，且砧木‘M9’的上升幅度高于砧木‘10-1’。

表1 长期中度干旱胁迫对不同苹果砧木生长形态指标的影响Table1 Effects of long-term moderate drought stress on growth and morphology indexes of different apple rootstocks

2.2 不同苹果砧木在长期中度干旱胁迫下的相对电导率和光合色素含量的差异

由图1a 所示，干旱胁迫时间的延长使3 种苹果砧木叶片的相对电导率呈现逐渐增大的趋势，并在干旱处理60 d 达到最大值。与干旱处理0 d 相比，干旱处理20 d 时，砧木‘13#30’的相对电导率显著增加，而另外2 种砧木的相对电导率不存在显著差异。干旱处理40 d 时，3 种砧木的相对电导率与干旱处理20 d 相比均显著增加。其中，砧木‘13#30’叶片的相对电导率增长了12.90%，上升幅度与砧木‘M9’（8.73%）和砧木‘10-1’（9.35%）相比较高。干旱处理60 d 时，各砧木的相对电导率与干旱处理40 d 相比均显著升高并且达到最大值。同时，与干旱处理0 d 相比，砧木‘13#30’相对电导率的增长幅度最大，砧木‘M9’的增长幅度最小，3 种砧木的相对电导率分别增长了33.59%、20.60%和24.50%。

图1 长期中度干旱胁迫对不同苹果砧木叶片相对电导率和光合色素含量的影响Fig.1 Effects of long-term moderate drought stress on relative conductivity and photosynthetic pigment content of leaves of different apple rootstocks

由图1b-d 所示，与正常供水相比，3 种苹果砧木叶片中的叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量在干旱处理结束后均显著减少。其中，砧木‘13#30’叶片中的总叶绿素含量与其对照组相比降低了46.56%，且其下降幅度与砧木‘M9’（32.37%）和砧木‘10-1’（40.38%）相比较高。于此同时，经过干旱胁迫后，3 种苹果砧木叶片中的类胡萝卜素含量呈现不同变化。砧木‘M9’叶片中的类胡萝卜素含量显著增加，而砧木‘13#30’和砧木‘10-1’叶片中的类胡萝卜素含量显著减少，且砧木‘13#30’类胡萝卜素含量的降低幅度大于砧木‘10-1’（图1e），2 种砧木的变化幅度分别为-21.81%和-9.89%。

2.3 不同苹果砧木在长期中度干旱胁迫下的光合参数和叶绿素荧光参数的差异

由图2a-c 所示，长期中度干旱胁迫下，3 种苹果砧木叶片的Pn和Tr均显著降低，但WUEi的变化不存在一定的规律性。其中，与正常供水相比，干旱胁迫下，砧木‘M9’Pn的降低幅度最小，且其Tr的降低幅度最大。砧木‘13#30’‘M9’和‘10-1’Pn的降低幅度分别为42.42%、24.26%和33.21%，Tr的降低幅度分别为10.58%、52.95%和32.80%。同时，干旱胁迫显著提高了砧木‘M9’叶片的WUEi，显著降低了砧木‘13#30’叶片的WUEi，但‘10-1’叶片的WUEi没有显著变化。由图2d-e 所示，与对照组相比，干旱胁迫使3种砧木叶片的F0均显著上升，且Fv/Fm均显著下降。其中，砧木‘M9’F0的增长幅度最小，且砧木‘13#30’Fv/Fm的降低幅度最大。砧木‘13#30’‘M9’和‘10-1’叶片F0的增长幅度分别为21.48%、11.40%和19.00%，Fv/Fm的降低幅度分别为1.66%、0.87%和1.28%。

图2 长期中度干旱胁迫对不同苹果砧木叶片的光合参数和叶绿素荧光参数的影响Fig.2 Effects of long-term moderate drought stress on photosynthetic and chlorophyll fluorescence parameters of leaves of different apple rootstocks

2.4 不同苹果砧木叶片在长期中度干旱胁迫下的抗氧化系统的差异

由图3a 所示，随着干旱胁迫时间的延长，3 种砧木叶片中的MDA 含量呈现逐增趋势，并且均在干旱处理60 d 时达到最大值。其中，与干旱处理0 d 相比，干旱处理20 d 时，砧木‘M9’和砧木‘10-1’的MDA 含量不存在显著差异，只有砧木‘13#30’的MDA 含量显著增加。干旱处理40 d 时，3 种砧木的MDA 含量与干旱处理20 d 相比均显著增加，且砧木‘13#30’叶片中的MDA 含量增长幅度高于另外2 种砧木。当干旱处理60 d 时，各砧木的MDA 含量与干旱处理40 d 相比均显著升高并且达到最大值，且与处理0 d 相比，砧木‘M9’叶片中的MDA 含量增长幅度低于另外2 种砧木。由图3b 所示，3 种砧木的SOD 活性均呈现先上升后下降的变化趋势。其中，砧木‘13#30’在处理20 d 时达到峰值，砧木‘M9’和砧木‘10-1’均在处理40 d 时达到峰值。干旱处理结束时，与处理0 d 相比，砧木‘13#30’和砧木‘10-1’的SOD 活性增长幅度相似，分别为6.93%和5.13%，但与砧木‘M9’的增长幅度相比较小，其增长幅度为17.60%。由图3c 所示，3 种苹果砧木的POD 活性均呈现先上升后下降的趋势。其中，砧木‘13#30’在处理20 d 时达到峰值，砧木‘M9’和砧木‘10-1’均在处理40 d 时达到峰值。干旱处理60 d 时，与处理开始时相比，砧木‘M9’叶片中的POD 活性增长幅度高于另外2 种砧木。由图3d 所示，3 种砧木的CAT活性均呈现先升高后降低的变化趋势，且均在干旱处理40 d 时达到峰值。干旱处理60 d 的植株与处理开始时的植株相比，砧木‘M9’叶片的CAT 活性上升幅度与另外2 种砧木相比较大。总体来看，砧木‘M9’在长期中度干旱胁迫下的SOD、POD 和CAT 活性增幅均高于砧木‘13#30’和砧木‘10-1’。

图3 长期中度干旱胁迫对不同苹果砧木抗氧化系统的影响Fig.3 Effects of long-term moderate drought stress on antioxidant system of different apple rootstocks

2.5 不同苹果砧木在长期中度干旱胁迫下的渗透调节物质含量的差异

由图4a 所示，与干旱处理0 d 相比，3 种苹果砧木叶片中的Pro 含量在干旱处理结束时均显著增加，但总体变化趋势有所不同。砧木‘13#30’呈现先上升后下降的趋势，另外2 种砧木为逐渐上升趋势，但砧木‘10-1’的Pro 含量在干旱处理后期没有显著差异。其中，Pro 积累最多的是砧木‘M9’，上升幅度与另外2 种砧木相比较高，砧木‘13#30’‘M9’和‘10-1’的增长幅度分别为47.71%、119.81%和81.10%。由图4b 所示，干旱胁迫下，3 种苹果砧木叶片中的SPC 具有不同趋势的变化。砧木‘13#30’和砧木‘M9’呈现先升高后降低的趋势，分别在干旱处理20 d 和40 d 增长到最大值，且砧木‘13#30’在干旱处理结束时的SPC 显著低于干旱处理开始时的SPC，而砧木‘M9’在干旱处理结束时的SPC 显著高于干旱处理开始时的SPC。砧木‘10-1’为逐渐增加的趋势，但胁迫处理40 和60 d 之间不存在显著差异。其中，干旱处理结束后，SPC 增加最多的砧木品种是‘M9’，与处理0 d 相比，增长幅度为98.59%；SPC 显著减少的砧木品种是‘13#30’，与处理0 d 相比，降低幅度为22.37%。

图4 长期中度干旱胁迫对不同苹果砧木渗透调节物质含量的影响Fig.4 Effects of long-term moderate drought stress on the content of osmotic regulators in different apple rootstocks

2.6 不同苹果砧木在长期中度干旱胁迫下的水分利用效率的差异

由图5a 所示，与正常供水相比，干旱胁迫使3种苹果砧木的干物质增长量均显著降低。其中，砧木‘13#30’干物质增长量的下降幅度高于另外2 种砧木，砧木‘13#30’‘M9’和‘10-1’的下降幅度分别为32.56%、10.45% 和31.45%。由图5b 所示，与正常供水相比，干旱胁迫显著提高了3 种苹果砧木的WUEL。其中，与对照组相比，干旱胁迫使砧木‘13#30’，砧木‘M9’和砧木‘10-1’的WUEL分别增加了 32.42%，73.81%和47.30%。同时，干旱处理结束后，3 种砧木的WEUL排序为：砧木M9 ＞ 砧木13#30 ＞ 砧木10-1。

图5 长期中度干旱胁迫对不同苹果砧木水分利用效率的影响Fig.5 Effects of long-term moderate drought stress on water use efficiency of different apple rootstocks

2.7 3 种苹果砧木各形态生理指标与水分利用效率的相关性分析

由表2 所示，类胡萝卜素含量和SPC 与WUEi呈显著正相关（P≤0.05）。WUEL与根冠比、CAT 活性和Pro 含量呈显著正相关，与Pn呈显著负相关，且与Tr呈极显著负相关（P≤0.01）。

表2 3 种苹果砧木各形态生理指标与水分利用效率之间的相关系数Table2 Correlation coefficients between physiological indicators and WUE of different apple rootstocks

3 讨论

水分在植物生长发育过程中承担着重要角色，其含量的缺乏会抑制苹果砧木幼苗地上部的生长［8］。本研究中，在长期中度干旱胁迫下，3 种苹果砧木的接穗高度、接穗直径、基砧直径和总叶面积均有不同程度的降低，这与孙协平［12］和刘彦超等［19］对苹果幼苗的研究一致。同时，干旱胁迫会增加植物地下部生物量分配，进而提高根冠比［20］，本试验中3种苹果砧木的根冠比均在干旱处理结束后显著增加，这与前人研究结论一致。此外，本研究发现，干旱胁迫使3 种苹果砧木叶片的比叶重发生不一致的变化，其中只有砧木‘M9’的比叶重在干旱处理结束后显著增加，说明砧木‘M9’对于所获取的资源具有较好的保留能力，且能更好地适应干旱环境［21］。

光合色素作为参与植物吸收、传递光能和引起原初光化学反应的重要色素，是促进植物正常进行光合作用的保障，但干旱胁迫会对植物光合色素含量造成显著影响［22-23］。其中，叶绿素含量是反应植株抗旱、避旱能力的重要指标之一［10］。类胡萝卜素是植物体内的抗氧化物质，在减轻和消除由干旱等逆境引发的活性氧（ROS）伤害方面发挥作用［24］。本研究中，在长期中度干旱胁迫下，苹果砧木‘M9’总叶绿素含量的下降幅度与另外2 种苹果砧木相比较低，且类胡萝卜素含量显著上升，说明苹果砧木‘M9’不仅具有较强的吸收利用光能的能力，可能还具有较高的减轻ROS 伤害的能力。与此同时，光合参数和叶绿素荧光参数是评价植物抗旱能力的重要指标［25］。本研究中，干旱胁迫使3 种苹果砧木叶片的Pn和Tr变化趋势一致，均显著下降，这与赵小琪等［26］对苹果幼树的研究结论一致。有研究表明，F0升高表明PSII反应中心受到伤害；Fv/Fm的变化反映胁迫下PSII 的损伤程度，Fv/Fm下降越多，表示PSII 损伤越大［27-28］。本研究中，苹果砧木‘M9’在干旱胁迫结束后，其F0的上升幅度和Fv/Fm的下降幅度低于另外2 种砧木，说明长期中度干旱胁迫对苹果砧木‘M9’叶片的PSII 损伤程度小于另外2 种砧木。

干旱胁迫会使植物细胞膜的通透性增大，电解质外渗，从而导致相对电导率升高，且一般认为相对电导率越大，植物抗旱性越弱［29］。本研究中，干旱处理结束后砧木‘M9’叶片的相对电导率显著低于另外2 种砧木，说明具有较强的抗旱能力。同时，植物细胞在干旱胁迫下会产生大量的活性氧引发膜脂过氧化反应，而MDA 作为膜脂过氧化作用的最终产物，其含量的高低可以反映植物的氧化损伤程度［30］。本研究中，苹果砧木‘M9’在干旱胁迫结束后的MDA 含量最少，说明遭受氧化损伤的程度最低。此外，本研究发现，苹果砧木‘13#30’在干旱胁迫后，不仅相对电导率显著高于另外2 种砧木，其叶片中的MDA 含量也显著高于另外2 种砧木，说明相对电导率与MDA 含量呈正相关，这与杨锋等［31］对苹果属植物的研究一致。植物为了减少氧化损害，在体内形成了酶促清除机制，其中 SOD、POD 和CAT 是重要的抗氧化酶，可以清除植物体内产生的活性氧，起到降低膜脂过氧化程度和膜受损程度的作用［32］。本试验中，与干旱处理0 d 相比，砧木‘M9’在干旱胁迫处理结束后的SOD、POD和CAT 活性的增长幅度均高于另外2 种砧木，说明其有较强的抗氧化能力，有效减少了活性氧的积累。此外，3 种苹果砧木叶片的SOD、POD 和CAT 活性呈先增后减的趋势，而MDA 含量为逐增趋势，说明干旱胁迫初期，在3 种抗氧化酶的联合作用下保护了植物不受ROS 伤害，维持了ROS 清除系统的动态平衡，但随着干旱胁迫时间的延长，ROS 持续积累，超过了植物本身的承受范围，导致抗氧化酶活性降低，这与郭爱霞等［6］对苹果砧木的研究一致。

渗透调节是植物抵御逆境胁迫的重要方式之一。渗透调节物质如Pro 和可溶性蛋白等的积累能降低细胞渗透势，增强植物从环境中吸收水分的能力，维持水分平衡［33］。本研究中，在长期中度干旱胁迫下，苹果砧木‘M9’和苹果砧木‘10-1’的Pro含量呈现持续增加的趋势，这与胡宏远等［34］研究一致。同时，苹果砧木‘13#30’的Pro 含量呈现先增加后减少的趋势，但与干旱处理0 d 相比，干旱处理结束后的Pro 含量呈显著增加，可能是因为在处理后期，干旱限制了其碳水化合物的合成导致谷氨酸生成受阻，进而影响Pro 的合成［35］。干旱胁迫结束后，Pro 含量增长幅度较高和SPC 显著增加的砧木品种是‘M9’和‘10-1’，说明其通过积累渗透调节物质，减轻逆境胁迫对植物细胞的伤害，维持细胞内正常代谢的能力强于苹果砧木‘13#30’。

WUE 目前已经逐渐成为评价植物抗旱节水能力的重要指标之一，包含了抗旱、耐旱、节水和高效用水等多个方面的内容［36］。有研究表明，适量缺水可以提高植物WUE［37］，同时也有研究表明，干旱胁迫对苹果幼苗的WUE 并不只起到促进作用，有时也会降低苹果幼苗的WUE［10,12,18］。本研究发现，干旱胁迫处理后，苹果砧木‘M9’叶片的WUEi显著提高，砧木‘13#30’和砧木‘10-1’的WUEi分别为显著降低和无显著差异。同时，与对照组相比，干旱胁迫使3 种苹果砧木的WUEL均显著增加，且干旱处理结束后，3 种砧木WUEL的高低排序为：砧木M9＞ 砧木13#30 ＞ 砧木10-1。为了进一步探究产生3 种苹果砧木WUE 差异的生理机制，本研究将相关形态生理指标与WUE 进行了相关性分析。发现，WUEi与类胡萝卜素含量和SPC 呈显著正相关；WUEL与根冠比、CAT 活性和Pro 含量呈显著正相关，与Pn呈显著负相关，且与Tr呈极显著负相关。综上所述，类胡萝卜素含量、SPC、根冠比、CAT 活性、Pro 含量、Pn和Tr可以作为评价植物WUE 的主要指标。

4 结论

在长期中度干旱胁迫下，3 种苹果砧木WUEL的高低排序为：砧木M9＞ 砧木13#30 ＞ 砧木10-1。同时，类胡萝卜素含量、SPC、根冠比、CAT 活性、Pro 含量、Pn和Tr可以作为评价植物WUE 的主要指标。