基于网络药理学探讨柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大的作用机制*

陈雅桐，贺红安，周 旭，张葆青△

1 山东中医药大学，山东 济南 250014； 2 山东中医药大学博士后流动站，山东 济南 250355；3 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014

腺样体肥大是儿科、耳鼻喉科的临床常见病。中医认为该病属“颃颡”“鼾证”等范畴，临床以鼻塞、打鼾为主症，可伴见听力下降、注意力不集中、认知障碍等症状，日久不愈甚至并发化脓性中耳炎、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征等疾病，严重危害患儿的身体健康［1］。西医治疗本病的保守治疗常予生理盐水局部冲洗、抗感染药物、鼻喷雾激素等治疗，但临床收效欠佳，易反复发作。手术治疗是目前最主要的治疗手段，但也存在切除不彻底、鼻咽狭窄、鼻咽功能不全、术后易复发等问题。中医治疗本病，疗效明显且持久，副作用小，具有明显的优势，可供临床医家的借鉴及运用。

柴胡桂枝干姜汤最早载于《伤寒论》，由柴胡、桂枝、干姜、黄芩、牡蛎、反蒌根、甘草组成。全方配伍上寒热并用、苦辛通降，集清热、化痰、散结、温阳于一体，专为治疗腺样体肥大诸类少阳病兼痰结而设。刘渡舟教授概括腺样体肥大的病机为“少阳胆热、太阴脾寒”，临床上使用柴胡桂枝干姜汤治疗呼吸系统、消化系统等凡是以“胆热脾寒”为核心病机的疾病，均取得了良好的疗效［2］。本文使用网络药理学的方法来系统性地探究柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大的相关作用机制，为指导临床用药提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 柴胡桂枝干姜汤有效化合物及作用靶点筛选及检索通过中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicinesystems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索柴胡、桂枝、干姜、黄芩、瓜蒌根的化合物，根据口服利用度（oral bioavailability，OB）、类药性（druglikeness，DL）药物半衰期（drug half-life，HL），设定OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h筛选出符合条件的候选化合物并获得其对应的潜在靶点信息，除去没有靶点及重合的成分。通过BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库检索牡蛎、炙甘草的化合物及其作用靶点，将有效化合物对应基因进行整理。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org）数据库中的UniProtKB 搜索功能，设定物种为人，将所得到的靶点全部校正为基因名，以解决药物靶点存在的名称不规范问题，利于进一步的与疾病靶点进行匹配。

1.2 疾病靶点的检索与预测以腺样体肥大（adenoid hypertrophy）为关键词，运用Genecards 数据库（https：//www，genecards.org）获取疾病的相关靶点与基因。

1.3 药物与疾病靶点的匹配运用Cytoscape软件，构建柴胡桂枝干姜汤“化合物-靶点”的可视化网络图。利用VENNY图（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将柴胡桂枝干姜汤有效成分的靶点与疾病靶点进行映射，得到柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大的相关靶点。

1.4 构建PPI 网络将疾病与药物的匹配靶点上传至STRING 数据库，以获取蛋白之间的相互作用关系，再使用Cytoscape 3.7.2 绘制关键靶蛋白PPI网络图。

1.5 基因功能及作用通路分析运用David 数据库（http：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对交集靶点进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析，包括生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）分析，通过KEGG 数据库进行生物通路分析，以阐明柴胡桂枝干姜汤对腺样体肥大的关键通路。

2 结果

2.1 柴胡桂枝干姜汤有效化合物筛选借助TCMSP数据库，以OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h为筛选条件，筛选出柴胡、桂枝、干姜、黄芩、瓜蒌根符合条件的候选化合物，运用BATMAN-TCM 数据库筛选出牡蛎、炙甘草符合条件的候选化合物，总共筛选出65 个候选化合物，其中柴胡13 个，桂枝6 个，干姜5 个，黄芩31 个，瓜蒌根2 个，牡蛎5 个，炙甘草3个。柴胡与麻黄芩共有的活性成分有1个，桂枝与黄芩共有的活性成分有3 个，桂枝与干姜共有的活性成分有2个，见表1。

表1 柴胡桂枝干姜汤中候选化合物相关信息

2.2 柴胡桂枝干姜汤有效活性成分的作用靶点借助TCMSP、Uniprot、BATMAN-TCM 数据库，共得到柴胡、桂枝、干姜、黄芩、牡蛎、瓜蒌根、炙甘草的作用靶点288个，并转化为基因。

2.3 腺样体肥大的相关靶点运用Genecards数据库获取腺样体肥大的相关靶点，处理后得到781 个。

2.4 药物与疾病靶点的匹配将柴胡、桂枝、干姜、黄芩、牡蛎、瓜蒌根、炙甘草的作用靶点基因与疾病的靶点基因上传到Cytoscape 3.7.2 软件，构建柴胡桂枝干姜汤“化合物-靶点”的可视化网络图，见图1。其中浅绿色圆形代表药物，深绿色菱形代表药物的靶点基因，红色、灰色、蓝色、粉色、紫色、橘黄色、淡蓝色八边形代表化合物，深蓝色六边形代表桂枝和干姜、黄芩的共有化合物，黄色六边形代表柴胡和黄芩共有化合物，玫红色六边形代表桂枝和黄芩共有化合物，每条边表示化合物与药物靶点之间的关系，Degree 越大说明化合物与靶点之间的关系越密切。其中，栎精、β-谷甾醇、堪非醇、豆甾醇、18β-甘草次酸、汉黄芩素、黄芩素等化合物与多个药物靶点相互作用，而PTGS1、PTGS2、HSP90AB1、NCOA2、PRKACA、AR 等靶点作用于多个化合物有效成分。利用VENNY 图将柴胡桂枝干姜汤有效成分的基因与疾病的基因进行匹配，得到共有基因118 个，分别为PTGS1、PTGS2、NCOA2、PGR、PLAU、HTR2A、NOS2、ESR1、AR、PPARG、ESR2、MAPK14、GSK3B、HSP90AB1、CDK2、PIK3CG、PIM1、CCNA2、CHEK1、NOS3、RELA、IKBKB、AKT1、BCL2、BAX、TNF、JUN、CASP3、MAPK8、MMP1、STAT1、CDK1、CYP3A4、CYP1A1、ICAM1、SELE、VCAM1、CYP1B1、ALOX5、GSTP1、AHR、GSTM1、MMP3、EGFR、VEGFA、CCND1、BCL2L1、FOS、CDKN1A、CASP9、MMP2、MMP9、MAPK1、IL-10、EGF、RB1、I-L6、TP53、ELK1、NFKBIA、ODC1、CASP8、TOP1、RAF1、SOD1、HIF1A、HSPA5、ERBB2、CAV1、MYC、GJA1、IL-1B、CCL2、CXCL8、BIRC5、HSPB1、TGFB1、IL-2、CCNB1、PLAT、IFNG、PTEN、IL1A、MPO、NFE2L2、NQO1、PARP1、CRP、CHUK、SPP1、RUNX2、RASSF1、E2F1、ACP3、CTSD、IGFBP3、IGF2、CD40LG、ERBB3、SLC6A4、LACTB、APOB、FASN、FASLG、CYP19A1、KDR、PRKCD、FN1、MCL1、CYCS、ALOX12、DMTN、SLC12A2、NR3C1、SRD5A1、CYP17A1、SHBG、IL-4。见图2。

图1 “化合物—靶点”的可视化网络图

图2 柴胡桂枝干姜汤与腺样体肥大交集靶点韦恩图

2.5 构建PPI 网络此网络图共包括关键节点118 个，Degree 的大小与节点的大小成正比，节点越大表示蛋白与蛋白之间的相互作用越大。结果如图所示，柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大的靶点按Degree 值排名依次为细胞肿瘤抗原p53（TP53）、RAC-α 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、血管内皮生长因子a（VEGFA）、caspase-3（CASP3）、转录因子ap-1（JUN）、白细胞介素6（IL-6）、myc 原癌基因蛋白质（MYC）、表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体蛋白（ESR1）等，这些蛋白的相互作用在网络中具有重要地位，可作为柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大的核心靶点进行进一步研究，见图3。

图3 柴胡桂枝干姜汤“蛋白-蛋白相互作用”网络示意图（PPI网络）

通过将药物与疾病的交集靶点上传至STRING 数据库来获得相应的人源蛋白。并将从STRING 数据库中获取的TSV 格式文件导入Cytoscape 3.7.2 软件构建药物成分-靶点网络，其中分子、靶蛋白以“节点”（node）表示，靶点与药物成分之间的关系以“边”（edge）表示。见图4。

图4 柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大网络图

2.6 基因功能及作用通路分析将118 个共有基因上传至David 数据库中的基因列表，标识码为OFFICIAL GENE SYMBOL，清单类型为基因表，将物种设定为“Homo sapiens”，对关键基因进行GO 富集及KEGG 通路分析，确定GO 富集主要涉及597 个生物学过程（biological process，BP），60个细胞成分（cellular component，CC）和106 个分子功能（Molecular Function，MF）。将GO 富集按P 值大小进行排序，其中BP 排名前10 的条目为凋亡过程的负调节、对药物的反应、基因表达的正调节、来自RNA聚合酶II启动子的转录的正调节、衰老、无配体时的外源性凋亡信号通路、转录的正调节、DNA 模板化、细胞对有机环状化合物的反应、细胞增殖的正调节、凋亡过程；CC排名前10的条目为细胞外间隙、胞质、线粒体、细胞核、细胞外区、膜、筏、核质、细胞质；MF排名前10的条目为酶结合、蛋白质结合、相同的蛋白结合、转录因子结合、蛋白激酶结合、蛋白质异二聚化活性、细胞因子活性、蛋白激酶活性、类固醇结合、血红素结合。分别取排名前20的条目作图，见图5。

图5 柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大GO富集分析柱形图

KEGG 通路富集分析主要涉及112 条通路，根据P值进行排序，取排名前20 的通路绘图，见图6。研究显示，肿瘤相关通路主要涉及癌症中的途径、hsa05215：前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、小细胞肺癌等疾病；调控细胞周期相关通路主要涉及细胞凋亡等；病毒感染相关通路主要涉及乙型肝炎、甲型流感等疾病；免疫炎症相关通路主要涉及肿瘤坏死因子信号通路、T 细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路等，以上表明柴胡桂枝干姜汤主要通过抗肿瘤、抗病毒、调控细胞凋亡、调节免疫及炎症因子水平等途径起到治疗作用。

图6 柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

腺样体病理性增生的病因主要包括以下几点：1）腺样体在儿童时期生长旺盛，儿童营养缺乏、抵抗力不足、寒冷刺激等引起的多种炎症可致其出现病理性肥大［3］；2）鼻炎、鼻窦炎时分泌物增多后流，刺激鼻咽后壁使腺样体肥大［4］；3）过敏及环境污染同样可造成腺样体肥大［5］。外科切除是目前西医治疗的主要手段，但腺样体具有免疫作用，且儿童时期局部免疫组织起主导作用，不宜过早切除［6］。研究证实，患儿行腺样体切除术1个月后的血清免疫球蛋白水平显著下降，对免疫功能造成负面影响［7］。

腺样体肥大属于中医学“鼾证”范畴，临床症状缠绵难愈，病因包括外因和内因，外因多是感受外邪，而内因多是肺、脾、肾亏虚与饮食内伤［8］。病机多从痰热、瘀热互结，痰湿结聚，寒热互结，虚实夹杂论治［9-12］。临床常见腺样体肥大患儿，多数有长期滥用抗生素和过服清热解毒类药物的病史，因小儿脾常不足，加之药物损伤脾阳，故脾失健运，津液转输不及，聚湿成痰，而小儿又为纯阳之体，痰饮郁而化热，随少阳胆经上犯，其基本病机可概括为少阳郁热，太阴虚寒［13］。柴胡桂枝干姜汤中柴胡、黄芩清泻胆经实热，疏利少阳枢机；桂枝、干姜、炙甘草温补脾阳以制脾虚生湿［14］；其功效与腺样体肥大的病机相切合，除此之外，瓜蒌根、牡蛎还可清热泻火，化痰散结［15］，二药合用既能除少阳郁热，促进脓涕排出，又有助于腺样体缩小。

本次网络药理学研究首先在TCMSP 中药系统药理学分析平台研究了柴胡桂枝干姜汤（柴胡、桂枝、干姜、黄芩、瓜蒌根、牡蛎、炙甘草）中的有效成分和作用靶点，通过化合物-药物靶点网络图显示：栎精、β-谷甾醇、堪非醇、豆甾醇、18β-甘草次酸、汉黄芩素、黄芩素是柴胡桂枝干姜汤最主要的有效化合物，PTGS1、PTGS2、HSP90AB1、NCOA2、PRKACA 是最主要的靶蛋白。在化合物中栎精是与药物靶点相互作用最多的活性成分，具有较强的抗菌、抗肿瘤、抗病毒作用；其次，β-谷甾醇、堪非醇、黄芩素等活性成分均具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用［16-17］，以上多种化合物相互协同可通过关键靶蛋白治疗腺样体肥大。

柴胡桂枝干姜汤主要通过细胞肿瘤抗原p53（TP53）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、caspase-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CASP3）、转录因子AP-1 中JUN、白细胞介素6（interleukin，IL-6）等靶点作用于腺样体肥大。IL-6由活化的T细胞产生，水平正常时参与免疫反应，当水平过高时参与炎症反应，且在反应中发挥核心作用［18］。研究显示，IL-6随着腺样体肥大的程度而升高，提示IL-6的大量释放易造成腺样体的炎症损害及免疫异常［19］。VEGF 是一种多功能细胞生长因子，其作用为加速新血管形成，以改善血供来缓解组织缺氧，实验显示，相较于正常及轻度腺样体肥大患者，缺氧情况较重的中、重度腺样体肥大患者的VEGF 水平明显升高［20］。由此可见，腺样体的病理性增生与炎症、低氧有着密不可分的关系，因此通过作用于靶点来降低IL-6、VEGF 水平对治疗该病具有重要临床意义。

根据GO 富集分析显示柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大的生物学过程主要体现在凋亡过程的负调节、对药物的反应、基因表达的正调节等方面。实验发现，低氧可延迟T 细胞凋亡，腺样体肥大并发阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者的CD4+/CD8+T 细胞比值高于正常及轻度患者，揭示免疫细胞凋亡紊乱加重腺样体增生［21-22］。KEGG 通路主要涉及TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、T细胞受体信号通路、Toll 样受体信号通路等。TNF 主要由激活的巨噬细胞产生，可促进炎症反应发生，腺样体肥大患儿TNF-α 的血清浓度较正常明显升高，且血清浓度越高，其腺样体肥大程度越重［23］，结合KEGG通路分析显示，作用于TNF信号通路可抑制TNF-α 在腺样体中的高表达。近年来研究发现，激活PI3K 通路可发挥抗氧化应激作用，从而缓解学习记忆的主要功能性脑区海马因低氧造成的神经细胞损伤，进而改善学习困难、注意力欠集中等症状［24］。综上，柴胡桂枝干姜汤正是通过多靶点多通路来治疗腺样体肥大的。

本研究基于网络药理学对柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大的作用机制进行了初步分析，预测柴胡桂枝干姜汤中有效活性成分（栎精、18β-甘草次酸、黄芩素等）通过PTGS1、PTGS2、HSP90AB1 等药物靶点发挥抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等作用。通过调节关键靶点（TP53、VEGFA、CASP3、IL-6）的表达，调节细胞凋亡等生物学过程，最终通过作用于相关通路（TNF 信号通路、T 细胞受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路等），抑制由炎症细胞因子造成的炎症反应，维持人体正常免疫功能，抗氧化应激，改善血供，缓解缺氧，达到治疗腺样体肥大的目的。本研究从微观角度探讨了柴胡桂枝干姜汤治疗腺样体肥大的作用机制，旨在为临床应用提供基础的生物信息学支撑，后续可进一步进行实验验证以指导临床。