麻黄附子细辛汤治疗缓慢性心律失常的网络药理学机制*

马春丽，于 艺，迟倩慧，张 蕾，刘 颖

山东中医药大学针灸推拿学院，山东 济南 250300

缓慢性心律失常（bradyarrhythmia，BA）是以心率减慢为特点的心血管疾病，分为窦性缓慢性心律失常、房室交界性心率、心室自主心律、传导阻滞，临床上常见于窦性心动过缓、病态窦房结综合征［1］。BA 病因形成复杂，主要原因是其冲动形成异常和传导异常［2］。其症状主要表现为长时间的心动过缓所引起的脏器供血不足，通常会引起心绞痛、冠心病、心功能障碍等疾病［3］。

麻黄附子细辛汤出自张仲景《伤寒杂病论》，由麻黄、附子、细辛等3 味药组成，其用量为麻黄、细辛各二两，制附子一枚，常用于治疗少阴感寒症。近代医家在继承仲景之志的基础上提出治疗心血管疾病的原则是温阳通气，方中附子辛甘大热，通行十二经之阳气，麻黄与附子同用，既散表寒又逐里寒，加之辛温发散的细辛，补散兼施，共奏温阳散寒之效。

1 资料与方法

1.1 麻黄、附子、细辛化合物及作用靶点、相应基因的检索与筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索麻黄、附子、细辛的化合物，再根据生物利用度（oral bioavailability OB）≥30%、类药性（drug-likeness DL）≥0.18、半衰期（Half Life HL）≥4 h，筛选出符合条件的候选化合物及相应的靶点信息。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org）数据库中的UniProtKB 搜索功能，将物种设定为人，将所得到的靶点全部校正为基因名。

1.2 BA 相关靶点的检索以bradyarrhythmia为关键词，运用GeneCards 数据库（https：//www，genecards.org）获取疾病的相关靶点与基因，去除重复值，得到BA相关靶点基因的数据库。

1.3 构建“麻黄附子细辛汤-化合物-靶点”的可视化网络图利用Venny 图（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将麻黄附子细辛汤有效成分的靶点基因与疾病的靶点基因取交集，得到麻黄附子细辛汤与BA 的关键靶点基因。运用Cytoscape 软件，构建“麻黄附子细辛汤-BA-化合物—靶点”的可视化网络图，分析得出麻黄附子细辛汤治疗BA的作用机制。

1.4 构建PPI网络将疾病与药物的共有关键靶点上传至STRING数据库，将物种设置为“人”，以获取蛋白之间的相互作用关系，下载结果中的TSV格式文档，摘取其中的node1、node2 和combined score 列数据并进行整理，利用Cytoscape 3.6.2软件绘制关键靶蛋白PPI 网络，根据degree 值找出关键靶点，以获取蛋白之间的相互作用关系。

1.5 基因功能及作用通路分析为了进一步说明与中药化合物对应的预测靶点在基因功能和作用通路中的作用，运用David 数据库（http：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对疾病与药物的关键靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和KEGG 生物通路分析，标识符选择OFFICIAL GENE SYMBOL，列表类型选择基因表，选择物种为“Homo species”，将阈值设定为P＜0.05，筛选排名靠前的生物过程和通路，并绘制barplot柱状图和图表，阐明麻黄附子细辛汤治疗BA的基因功能和关键通路。

2 结果

2.1 麻黄附子细辛汤药物活性成分借助TCMSP数据库，以OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h为标准，筛选出符合条件的候选化合物共52 个，其中麻黄23个，附子21个，细辛8个。除去无对应靶点后剩余主要活性成分36 个，其中麻黄的活性成分有22个，附子的活性成分有7 个，细辛的活性成分有8个，细辛与麻黄共有的活性成分有1个。见附表1。

表1 大黄附子细辛汤抗BA KEGG通路富集分析

表2 麻黄附子细辛汤候选化合物相关信息

2.2 麻黄附子细辛汤活性成分的作用靶点预测借助TCMSP、Uniprot 数据库获取麻黄附子细辛汤的作用靶点并去除重复值，共得到麻黄、附子、细辛的作用靶点229个，并转化为基因。

2.3 BA的相关靶点运用GeneCards数据库获取BA的相关靶点，去除重复及人没有的后得到595个。利用Venny 图将麻黄附子细辛汤中的作用靶点与BA的相关靶点取交集，获得交集靶点65个，见图1。

图1 麻黄附子细辛汤与BA交集靶点韦恩图

2.4 “麻黄附子细辛汤-化合物-靶点”的可视化网络图将麻黄附子细辛汤的作用靶点基因的靶点基因上传到Cytoscape 3.7.2 软件，构建“麻黄附子细辛汤-化合物—靶点”的可视化网络图。其中浅绿色圆形代表药物，深绿色菱形代表药物的靶点基因，粉色、黄色、蓝色六边形代表化合物，紫色六边形代表麻黄和细辛共有化合物，每条边表示化合物与药物靶点之间的关系，degree 越大说明化合物与靶点之间的关系越密切。其中排名前四的化合物为槲皮苷，山柰酚，木犀草素，多根乌头碱，说明这些化合物可能是麻黄附子细辛汤治疗缓慢性心律失常的关键化合物，而degree 值排名前5 的靶点为PRSS1、PTGS2、NCOA2、HSP90AB1、DPP4，作用于多个化合物有效成分，体现了麻黄附子细辛汤治疗BA 中多成分、多靶点的作用机制，见图2。

图2 “麻黄附子细辛汤-化合物-靶点”的可视化网络图

2.5 构建PPI 网络将药物与疾病的65 个交集靶点上传到STRING 数据库，限定研究物种为“Homo sapiens”，获得相应人源蛋白。并将从STRING 数据库导出的文件中的node1、node2 和Combined score 信息导入Cytoscape 3.7.2 软件构建药物成分-靶点网络，以探究麻黄细辛附子汤的药理学作用机制，其中“节点”（node）表示分子、靶蛋白，“边”（edge）表示成分与靶点之间的关系。见图3。此网络图共包括关键节点65个，Degree越大，其节点越大，蛋白与蛋白之间的作用越大。结果表明麻黄附子细辛汤治疗BA 的靶标中，degree值排前十的为IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL-1B、FOS、NOS3、IL-10、CAT、ICAM1。见图4。

图3 麻黄附子细辛汤抗BA网络图

图4 麻黄附子细辛汤-缓慢性心律失常的PPI网络示意图

2.6 基因功能及作用通路分析将65 个关键靶点上传至David 数据库中的基因列表，标识码为OFFICIAL GENE SYMBOL，清单类型为基因表，选择物种为“Homo sapiens”，对关键基因进行GO 富集及KEGG 通路分析，GO 富集主要涉及100 个生物学过程（biological process，BP），14 个细胞组成（cellular component，CC）和15 个分子功能（molecular function，MF）。将GO 富集按P值大小进行排序，其中BP排名前20的条目为腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、去甲肾上腺素-肾上腺素血管收缩参与全身动脉血压调节、磷脂酶C激活G-蛋白耦合受体信号通路、细胞信号、氧化还原过程、过氧化氢生物合成过程、免疫反应、膜蛋白外膜蛋白的正调控、宿主共生体生长的负调控、通过死亡域受体对外在凋亡信号通路的负调控、正调控平滑肌收缩、细胞对脂多糖的反应、一氧化氮生物合成过程的正调控、胞质钙离子浓度的正调控、炎症反应、血管收缩的正向调节、平滑肌细胞增殖的正调控、内皮细胞凋亡过程的负调控、血管生成的正调控、正调控钙化二醇1-单氧合酶活性，CC 排名前十的条目为细胞外隙、等离子膜的整体成分、神经元投影、细胞外基质、等离子膜的外侧、细胞表面、线粒体外膜、受体复合体、GABA-A受体复合体、胞外体，MF排名前10的条目为α1-肾上腺素受体活性、去甲肾上腺素结合、血红素结合、肾上腺素结合、细胞因子活性、NADP 绑定、蛋白质同二聚化活性、生长因子活性、肿瘤坏死因子受体结合、多巴胺绑定，见图5。KEGG 通路分析主要涉及69 条通路，根据P值进行排序，其中排名前20 的分别为疟疾、恰加斯病（美国锥虫病）、风湿性关节炎、非洲锥虫病、TNF 信号通路、炎症性肠病、Toll 样受体信号通路、乙肝、神经活性配体受体相互作用、异体排斥、钙信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、HIF-1 信号通路、癌症中的转录失调、T 细胞受体信号通路、阿米巴病、弓形体病、cGMP-PKG 信号通路、利什曼病、5-羟色胺能突触，见表1—2。

图5 大黄附子细辛汤抗BA GO富集分析柱形图

3 讨论

BA 是以心率减慢为特征的心血管疾病，大多好发于老年人，其中以病态窦房结综合征最为常见。病因主要是由于多种原因造成窦房结自律性降低，导致窦房功能衰竭、起搏功能障碍、传导功能障碍、G蛋白基因表达障碍的疾病［4］。BA的临床表现早期并不明显，随病情加剧逐渐表现为乏力、心悸、头晕、嗜睡、记忆力减退，严重时导致心绞痛、心力衰竭等［5］。现代医学对BA的治疗，一般采用阿托品、莨菪碱等药物，药物长期效果不稳定，副作用大，病情严重者通常安装永久性心脏起搏器改善症状，价格昂贵且作用期限有限［6］。故中医药治疗BA具有重要的临床意义和发展前景。

祖国医学通常将BA 归为“心悸”“怔忡”“迟脉”范畴，历代医家对其病因病机都有不同的见解，大多认为本病为本虚标实之证。病机大多为“心脉瘀阻““心气亏虚”“阳气亏虚”。周次清［7-8］认为，阳气虚衰是病态窦房结综合征发病的根本，阳气主动，对人体各脏腑起着温煦和推动的作用。心阳亏虚无力鼓动心脏搏动，温运血脉，脾为气血生化之本，脾阳不振导致运化失常，脾湿生痰，痰浊心包，蒙蔽心神，影响气血发源，进一步影响其他脏腑的生理功能。肾为元阴元阳之本，心阳、脾阳根于肾阳，肾阳不足影响心阳、脾阳等阳气的生成。因阴阳互为对立又互相转化，故肾阳不足日久，引起肾阴不足，阴不敛阳，阴阳不相顺接，导致阴阳两虚，形成寒凝、血瘀、痰浊等由虚转实的病理产物。刘渡舟认为，心为阳中之阳脏，以阳气为用，故心脏病亦恒多阳气之病，或阳气太过，或阳气不足［9］。老年人阳气虚弱，心阳不足时会出现心搏频率下降、脉迟缓无力、胸闷气短等症状。中医药治疗BA 主要以麻黄附子细辛汤、四逆汤、参附汤、血府逐瘀汤等为主。刘小锋等［10］筛选病态窦房结综合征致BA患者41例，采用麻黄附子细辛汤加味进行治疗，结果显示总有效率95%。说明益气温阳、通络活血的中药可以改善窦房结功能，提高心率。王海波［11］选取BA患者60例，治疗组采用麻黄附子细辛汤和阳和汤治疗，对照组采用阿托品治疗，结果治疗组总有效率95%，对照组总有效率76.67%。杨周宇等［12］选取70 例BA 的患者，给予麻黄附子细辛汤加味治疗，结果显示显效36例，有效29 例，说明麻黄附子细辛汤在提高BA 患者心率方面有明显效果。

麻黄附子细辛汤出自《伤寒论》第301 条：“少阴病，始得之，反发热，脉沉者，麻黄附子细辛汤主之。”原方主要治疗阳虚外感之证，肾阳为一身阳气之本，温煦肾阳，诸脏腑阳气得之裨益［13］。《神农本草经》云附子：“主风寒咳逆邪气，温中，金疮，破癥坚、积聚血癥”，上助心阳通利百脉，下补肾阳补益元气，加之麻黄、细辛共奏温经散寒，助阳解表之功。童妍等［14］通过观察附子对BA 大鼠cAMPPKA 信号转导通路的影响得出附子能提高缓BA大鼠Na+-K+-ATP 酶活性，升高大鼠心肌cAMP 含量，升高心肌PKA 含量，具有强心肌的作用。景红娟［15］指出麻黄碱有兴奋心脏的作用，且麻黄碱的浓度越高，加快心率、抑制心电图上QT 间期的效果越明显。黄顺旺［16］证实细辛醇提液对离体兔和豚鼠心脏具有明显的兴奋作用，增强心肌收缩力，加快心率。研究表明，麻黄附子细辛汤可明显提高BA的心率。

本次研究首先在TCMSP 中药系统药理学分析平台研究了麻黄附子细辛汤（麻黄、附子、细辛）中的有效成分和作用靶点，通过化合物-药物靶点网络图显示：槲皮苷、木犀草素、山柰酚、多根乌头碱、去甲乌药碱、儿茶酚等化合物与多个药物靶点相互作用，故说明它们是麻黄附子细辛汤中的有效化合物成分，PRSS1、PTGS2、NCOA2、HSP90AB1、DPP4 是化合物-药物靶点中的关键靶点。麻黄附子细辛汤主要通过IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL1B、FOS、NOS3、IL10、CAT、ICAM1 作用于BA，可能是核心靶点。JANSSEN 等［17］通过体外试验，发现IL-6对心肌有负性效应，低浓度的IL-6可能导致心肌肥大，而高浓度的IL-6 可能影响心肌并产生扩张，进一步导致心律失常的发生，可见IL-6 水平与心室扩张和心肌收缩功能的减退等程度呈正相关。

根据GO 富集分析显示麻黄附子细辛汤治疗BA 的生物学过程主要体现在腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、去甲肾上腺素-肾上腺素血管收缩参与全身动节脉血压调等方面。腺苷酸环化酶通过调控细胞内第二信使cAMP，引起细胞内的酶反应或者微环境变化，产生一系列的生理效应，包括心脏收缩、免疫反应等，AC6 从哺乳动物心脏中介导β-肾上腺素能受体刺激的信号异构体［18］。TANG 等［19］在心力衰竭小鼠模型的研究中发现，AC6 可明显缓解心力衰竭，增强心肌收缩力。细胞组成主要体现在细胞外隙、等离子膜的整体成分、神经元投影等。分子组成则主要体现在α1-肾上腺素受体活性、去甲肾上腺素结合、血红素结合等。去甲肾上腺素在心血管疾病中具有增加心率、加强心肌收缩的作用［20］。KEGG 通路主要涉及TNF信号通路、Toll样受体信号通路、钙信号通路、cGMP-PKG 信号通路等。心律失常与心肌细胞内Ca＋浓度有重要联系，张青［21］证明TNF-α可能通过增加心室肌细胞胞内Ca＋浓度，致心肌细胞早期后除极，引起心肌梗死室性心律失常。本研究中麻黄细辛附子汤治疗BA 的KEGG 分析结果中亦包含有钙信号通路，说明钙信号具有成为缓慢型心律失常治疗靶点的潜质。研究表明，抑制炎症途径可能有助于预防血管损伤。TNF-α 也被证明能刺激内皮细胞释放的内皮微粒，参与内皮细胞的凋亡。因此，TNF-α 抑制剂在预防血管功能障碍方面有新的作用［22］，可以增强心肌收缩力，提高心率。HAN 等［23］研究发现，cGMP 含量的增加可有效激活PKG，保护心肌细胞，进一步降低心律失常的发病率。赵灿等［24］发现，心肌肌钙蛋白在被cAMP 活化的钙调素依赖性蛋白激酶作用下磷酸化，参与细胞收缩等生理功能，增加心肌收缩力从而改善心律失常。

综上所述，本研究通过网络药理学对麻黄附子细辛汤干预BA 的作用靶点及相关通路进行深入分析，通过IL-6、TNF、VEGFA 等核心靶点的表达作用于腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、去甲肾上腺素-肾上腺素血管收缩参与全身动脉血压调节等生物过程，并作用于TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、钙信号通路、cGMP-PKG 等信号通路，从而增强心肌细胞收缩力，提高心率，达到治疗缓慢性心律失常的目的。本研究仍有很多不足，比如像Toll 样受体信号通路未找到其作用机制，但仍希望为中医药治疗BA的药理学研究提供新的思路，旨在为临床应用麻黄附子细辛汤治疗BA提供基础的生物信息学支撑。