液相色谱仪计量性能期间核查

李大伟，许诚，张利明，王春民，夏瑜

（1.苏州市疾病预防控制中心，江苏苏州 215004； 2.苏州市计量测试院，江苏苏州 215100）

液相色谱仪是化学分析检测实验室最常用的一种设备，在食品检测领域，主要用于食品营养成分检测[1]、食品添加剂检测[2-4]、农药残留检测[5-8]、微生物代谢物检测[9-11]等；此外，在水环境监测领域，主要用于阴离子检测[12]、有机物质检测[13-14]、污染物质检测[15-16]等。分析检测实验室的最终产品就是检测报告，然而检测数据的准确性和有效性会直接影响到所出具的检测报告的正确性和法律效力[17-18]。为了保证实验室检测数据的准确性，除了外部的能力验证、计量比对以外，实验室内部的仪器设备期间核查也是一个重要的核查手段。期间核查是检查被核查对象是否保持原校准/检定的状态，维持其最佳溯源/测量能力，以便及时发现被核查对象的失准程度，以保证检测数据的准确可靠[19-20]。

实验室对液相色谱仪的期间核查，可根据使用需求的具体情况而采取相应的核查方法，如用咖啡因标准品带入仪器检测，计算示值误差，与判定标准进行比较；然而很少有人对液相色谱仪计量性能做过系统的期间核查。笔者参照JJG 705—2014《液相色谱仪》并结合自身的工作经验，对液相色谱仪计量性能的期间核查进行了探讨。该方法的实验数据可为实验室液相色谱仪管理者提供仪器评价依据，同时也为食品、药品企业验证液相色谱仪计量性能提供参照依据。

1 期间核查的准备

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Waters 2695 型，配备二极管阵列检测器(2996 PAD)，美国沃特世公司。

液相色谱液体流量计：5025000 型，英国GJC Instruments公司。

超纯水仪：Milli-Q型，美国密理博公司。

丙酮、异丙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

紫外分光光度计校准用标准溶液：编号为GBW(E) 130066，中国计量科学研究院。

萘的甲醇标准溶液：(1) 1.00×10-4g/mL，编号为GBW (E) 130167；(2) 1.00×10-7g/mL，编号为GBW(E) 130168。中国计量科学研究院。

甲醇：色谱纯，德国默克公司。

1.2 溶液配制

丙酮溶液：丙酮体积分数为0.1%，准确量取1 mL丙酮，转移至1 000 mL容量瓶中，加入超纯水定容至标线。现配现用。

异丙醇溶液：异丙醇体积分数为2%，准确量取20 mL异丙醇，转移至1 000 mL容量瓶中，加入超纯水定容至标线。

丙酮-2%异丙醇系列混合溶液：先配制1.0%丙酮-2%异丙醇水溶液，再以此为母液进行稀释。准确量取1 mL丙酮，转移至100 mL容量瓶中，加入异丙醇溶液定容至标线，即为1.0%丙酮-2%异丙醇水溶液；再分别量取1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL母液，用2%异丙醇溶液定容于10 mL容量瓶中，得丙酮体积分数分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%的丙酮-2%异丙醇系列混合溶液。现用现配。

2 期间核查的实施

2.1 泵流量设定值误差SS和流量稳定性SR核查

JJG 705—2014中采用容量瓶收集流动相、秒表计时、天平称量的方法来进行测定。该方法的准确度受较多因素影响，如容量瓶准确度等级、温度对容量瓶容量准确度的影响，以及流动相的挥发性、秒表的误差、天平的误差、天平室的温湿度的影响等，且该法操作繁琐。变更方法：在流动相出口处采用两通连接液体流量计，在液相色谱仪液晶面板或者工作站上设定流量分别为0.5、1.0、1.2 mL/min，从液体流量计上读取流量测定值，测量数据见表1。测量相对误差SS和稳定性SR分别按式(1)、式(2)计算：

表1 流量设定值、实测值、相对误差、稳定性Tab.1 Set value, measured value, relative error and stability of flow

FS——流量设定值，mL/min；

Fmax——流量3次测量值的最大值，mL/min；

Fmin——流量3次测量值的最小值，mL/min。

2.2 梯度误差核查

参照JJG 705—2014设置色谱条件。流动相：A通道为超纯水，B通道为0.1%(体积分数)丙酮溶液，流量为2 mL/min；分析波长：254 nm。用两通代替色谱柱。

开机后，以A通道(超纯水)冲洗系统，待基线平稳后执行梯度洗脱程序，JJG 705—2014中未给出梯度洗脱程序的时间，笔者给出了如表2 所示的梯度洗脱程序。执行梯度洗脱程序时，利用色谱工作站软件设置空针进样，并记录色谱图，即梯度变化曲线如图1所示。

图1 流动相B不同体积分数时的信号值Fig.1 Signal values of different volume fraction mobile phase B

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution program

重复测量2次，记录每一段阶梯对应的Y轴响应信号值，第一次测量的6 段阶梯信号值L1i分别为0.000 03、0.037 92、0.076 00、0.114 05、0.151 85、0.189 88，用后一个测定值减去前一个测定值得到5组数据，即(L1i-L1(i-1))的值；同理得出第二次测量的6段阶梯信号值L2i和(L2i-L2(i-1))数据，利用式(3)～式(5)分别计算第i段阶梯响应信号值的平均值■Li、5段阶梯响应信号值的总平均值■Li及某段阶梯的梯度误差Gi。

梯度误差测量值及计算结果见表3。

表3 梯度误差测量值及计算结果Tab.3 Measured values and calculated results of gradient error

2.3 波长示值误差和重复性核查

JJG 705—2014中，用注射器将紫外分光光度计校准用标准溶液从检测器入口注入样品池中，采用直接注入法，标准溶液用量大且容易造成检测器污染，故对方法进行如下变更：流动相：A 通道，100%超纯水，流量为1 mL/min；扫描波长：210～400 nm；用两通代替色谱柱。进样10 μL紫外分光光度计校准用标准溶液时的光谱扫描图如图2所示。

图2中，波峰(或波谷)对应的波长与参考波长之差为波长示值误差。每个波长重复测量3 次，其中最大值与最小值之差为波长重复性，测量结果见表4。

表4 波长示值误差与波长重复性核查结果Tab.4 Verification result of wavelength indication error and wavelength repeatability

2.4 基线噪声、基线漂移和最小检测浓度核查

参照JJG 705—2014，在液相色谱仪工作站上测量出基线噪声、30 min 内基线漂移分别为1.6×10-4、8×10-4，选用C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量设为1.0 mL/min，检测器波长设置为254 nm，进样1.00×10-7g/mL 萘的甲醇标准溶液10 μL，记录萘-甲醇色谱峰高，按照公式(6)计算最小检测质量浓度：

式中：ρL——最小检测质量浓度，g/mL；

Nd——基线噪声；

ρ——萘的甲醇标准溶液质量浓度，g/mL；

V——进样体积，V=10 μL；

H——萘-甲醇色谱峰高；

20——标准进样体积，μL。

实验测得1.00×10-7g/mL 的萘-甲醇标准溶液色谱峰高为725×10-6，代入式(6)，计算得ρL为2.2×10-8g/mL。

2.5 线性范围核查

JJG 705—2014中，用注射器直接向检测池中注射丙酮-2%异丙醇溶液，手动注入的速度难以保持恒定一致，结果重现性较差，并且手动注入容易造成检测器污染。变更方法如下：流动相：2%异丙醇溶液，流量为1 mL/min；分析波长：254 nm；用两通代替色谱柱。

选择丙酮-2%异丙醇系列混合溶液(丙酮体积分数分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%)分别进样测定，进样体积均为10 μL，色谱图如图3 所示，得到的线性范围数据如表5所示。

图3 丙酮-2%异丙醇水溶液的色谱图Fig.3 Chromatogram of acetone-2% isopropyl alcohol aqueous solution

表5 线性范围核查试验结果Tab.5 Verification result of linear range

表5 中，以丙酮体积分数分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和对应的色谱峰面积平均值进行线性回归，得标准曲线线性方程y=1 246.8x-7.24，利用线性方程计算丙酮体积分数大于0.5%各浓度点的色谱峰面积，并与对应的色谱峰面积测量平均值比较，计算出相对误差，以相对误差大于5%所对应的丙酮体积分数作为检测上限φH，由表5可知φH为0.6%。参照文献[21]，将低浓度(丙酮体积分数为0.1%)丙酮-2%异丙醇溶液稀释至100倍体积后进样(10 μL)测定，测得色谱峰高为159×10-6，基线噪声为6×10-5，按照式(7)计算的φL为3.8×10-6，根据JJG 705—2014，以φH/φL作为线性范围，计算结果为1 578.9。

式中：φL——丙酮最小检测体积分数，%；

Nd——基线噪声；

φ——丙酮-2%异丙醇溶液稀释后丙酮的体积分数，φ=1.0×10-5；

V——进样体积，V=10 μL；

H——萘-甲醇色谱峰高；

20——标准进样体积，μL。

2.6 定性、定量重复性核查

按照2.4 色谱条件，连续进样质量浓度为1.00×10-4g/mL的萘-甲醇溶液6次，记录色谱峰面积和保留时间，计算对应的相对标准偏差，结果列于表6。定性重复性用色谱保留时间的相对标准偏差表示；定量重复性用色谱峰面积的相对标准偏差表示。由表6可知，定性重复性为0.5%，定量重复性为0.8%。

表6 定性、定量重复性核查试验结果Tab.6 Verification result of qualitative and quantitative repeatability

3 核查结果判定

综合泵流量设定值误差、流量稳定性、梯度误差、波长示值误差、波长重复性、基线噪声、基线漂移、最小检测质量浓度、线性范围、定性重复性、定量重复性11 个方面的核查数据，结果表明，以上11 个方面的核查结果均符合JJG 705—2014 中对液相色谱仪计量性能的要求(表7)。

表7 液相色谱仪计量性能技术要求Tab.7 Technical requirements for metrological performance of liquid chromatography