基于AHP-隶属函数法的棉花子叶期耐低钾能力鉴定

谭志新 谢留伟 李洪戈 李芳军 田晓莉,* 李召虎

1中国农业大学农学院作物化控研究中心, 北京 100193; 2中国农业科学院棉花研究所品种资源研究室, 河南安阳 455000

钾是植物维持生长发育所必需的营养元素, 钾离子(K+)在酶原激活、蛋白质合成、光合作用、渗透调节、气孔运动、能量传递、韧皮部运输、离子平衡和抗逆性等方面发挥重要作用[1-6]。植物正常K+浓度范围为80～150 mmol L–1[7], 约占植物干重2%～10%, 占植物灰分质量50%左右[8-9]。

棉花是我国重要的经济作物, 具有无限生长和生殖阶段持续时间长的特点, 是典型的喜钾作物[10-11]。而棉花根系属于直根系, 根量相对较少, 钾吸收能力偏低, 对土壤缺钾较其他大田作物更为敏感[12-13]。增施钾肥可以改善棉花钾营养, 但不利于棉花生产的可持续发展。如能利用棉花的遗传多样性和基因型差异, 挖掘其自身的耐低钾潜力, 将是解决棉花钾营养需求和钾资源短缺矛盾的有效途径。

目前筛选鉴定棉花钾营养高效基因型的方法主要包括田间条件下的全生育期试验法和控制条件下的苗期试验法[14]。田晓莉等[15]曾报道, 子叶缺钾斑相对面积可作为棉花苗期耐低钾基因型筛选的辅助指标, 但未关注子叶期其他性状与耐低钾能力的关系。鉴于子叶期具有培养条件易于控制、鉴定周期短、鉴定通量大等优势, 本研究探讨了在子叶期进行棉花耐低钾能力鉴定的可行性。此外, 关于作物养分效率的鉴定常需要结合多个指标才能提高结果的全面性和准确性, 而每个指标对棉花耐低钾能力的贡献存在差异, 需要结合实际生产需求, 才能对鉴定指标的重要程度做出合理判断[16]。

AHP (Analytic Hierarchy Process)层次分析法是将定性与定量方法有机结合的经典决策理论, 通过比较因素之间的重要程度来分配合理的权重, 将决策思维数学化、系统化, 有利于量化不同因素对结果的影响。隶属函数法作为一种常用的综合评价方法,广泛应用于作物抗旱[17]、耐盐[18]等抗逆性状的评价。

本文利用决策模型AHP-隶属函数法对384份棉花种质材料子叶期的9个鉴定指标进行系统分析,以期建立棉花子叶期耐低钾能力的综合比较体系、筛选具有耐低钾能力的棉花种质材料, 从而为棉花耐低钾育种工作和耐低钾栽培提供参考和依据。

1 材料与方法

试验于2020—2021年在中国农业大学西校区光照培养室内进行, 光照/黑暗时长为12 h/12 h, 昼夜温度为(28±2)℃/(22±2)℃, 相对湿度控制在70%～80%, 光照强度为380 μmol m–2s–1。试验材料为中国农业科学院棉花研究所品种资源研究室提供的384份重测序棉花种质材料, 种子2018年产自河南安阳, 品种名称见附表1。

表1 棉花子叶期耐低钾能力评价指标的基因型变异分析Table 1 Genotypic variations in evaluation index of low potassium tolerance at cotyledonary stage of cotton

1.1 试验设计

种子用9%的双氧水消毒20 min, 清水冲洗种子表面残余双氧水, 浸泡至露白, 播种于不含K+的沙床, 3 d后将子叶平展的幼苗转移至K+浓度为0.03 mmol L–1[15]的改良Hoagland培养液(0.03 mmol L–1KNO3, 2.5 mmol L–1Ca(NO3)2, 1 mmol L–1MgSO4,0.5 mmol L–1(NH4)H2PO4, 0.1 mmol L–1FeNaEDTA,2×10–4mmol L–1CuSO4, 1×10–3mmol L–1ZnSO4,2×10–2mmol L–1H3BO3, 5×10–6mmol L–1(NH4)6Mo7O24和1×10–3mmol L–1MnSO4)中培养, 用气泵24 h通气。每个培养盒(19 cm×14 cm×7.5 cm)内含1.5 L营养液, 移入3份种质材料, 每份材料4株; 所有材料重复3次(盆)。

1.2 测定项目与测定方法

移苗后第6天进行各指标记录和测定。

1.2.1 子叶与下胚轴夹角 调整幼苗子叶朝向,使子叶正对相机进行照相; 利用ImageJ图像分析软件(National Institutes of Health, 美国)测定子叶与下胚轴夹角, 首先沿幼苗下胚轴作出参考线, 再沿子叶切面做出参考线, 2条参考线形成的夹角即为子叶与下胚轴夹角(图1)。

图1 子叶与下胚轴夹角的测定Fig. 1 Determination of the angle between cotyledons and hypocotyls

1.2.2 缺钾斑相对面积 将子叶取下平铺于蓝色塑料板, 并用透明玻璃板镇压平展, 之后用相机垂直拍照获得子叶及缺钾斑(褐色水渍状斑点)照片;利用ImageJ图像分析软件(National Institutes of Health, 美国)对缺钾斑进行标记(图2), 根据子叶及所有缺钾斑区域像素点分量计算缺钾斑面积占子叶面积的比例。

图2 子叶缺钾斑面积测定Fig. 2 Determination of the area of potassium-deficient spots in cotyledons

1.2.3 根系形态参数 使用扫描仪(EPSON-V700,日本)扫描根系, 应用WinRHIZO根系分析软件(WinRHIZO REG2009, 加拿大)统计根系总长度、总表面积、总体积、平均直径等根系形态参数。

1.2.4 植株干重 植株(子叶、下胚轴与根系)先在105℃下杀青30 min, 然后在85℃下烘干至恒重后称量。

1.2.5 K+浓度 植株样品或种子样品(每份20粒, 分为种壳和种仁)进行粉碎、过筛, 准确称量0.2 g置于10 mL离心管中, 加入5 mL HCl (1 mol L–1), 在28℃下于220转 min–1的摇床中震荡浸提10～12 h, 后置于5℃离心机(1800×g)中离心15 min, 吸取50 μL上清液, 再加入HCl (1 mol L–1)稀释至5 mL, 用原子吸收分光光度计(SpectAA-50/55, Varian, 澳大利亚)测定K+浓度。

1.2.6 K+积累量 计算公式为: K+积累量(mg)=植株生物量(g)×K+浓度(mg g–1)。

1.3 AHP-隶属函数模型

由AHP法和隶属函数法构成AHP-隶属函数模型, AHP法用来确定指标的权重值, 隶属函数法用来计算指标的隶属函数度值, 最后累加各鉴定指标赋权后的隶属函数值, 对供试材料的耐低钾性进行综合评价。

1.3.1 构建判断矩阵A 从鉴定指标中确定评价指标来构建判断矩阵A。

1.3.2 权重计算及矩阵检验 步骤如下:

① 计算判断矩阵A各行所有因素乘积得向量Mi,, 式中,xij表示第i行, 第j个因素的数值,n表示评价指标数量(下同);

②Mi的n次开方得向量

③ 向量归一化得权向量Wi,

④ 计算特征向量AWi, AWi=A×Wi;

⑤ 计算最大特征值λmax,

⑦ 根据平均随机一致性指数(RI)表, 计算一致性比率CR,

⑧ 若CR小于0.1, 则判断矩阵A一致性检验通过, 否则需要重新构建判断矩阵A。

1.3.3 计算正负隶属函数值

X+= (Xij–Xi,min)/(Xi,max–Xi,min);

X–= 1 – (Xij–Xi,min)/(Xi,max–Xi,min)

式中,X+和X–分别表示正负隶属函数值,Xij表示第i品种的第j评价指标的数值,Xi,max和Xi,min分别表示鉴定材料第j评价指标的最大值和最小值。

1.3.4 计算种质材料的综合评价值C

计算公式:C∑Xi×Wi

式中,Xi表示第i个品种各评价指标的隶属函数值,Wi表示各评价指标的权重。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2019进行数据整理, 使用R语言(R Core Team, 2022)进行统计分析并绘图制表。

1.4.1 相关性分析 利用correlation包的correlation函数, 使用Spearman方法计算各评价指标间的相关系数r1; 应用Pearson方法计算种子K+含量与耐低钾能力之间相关系数r2, 并通过Holm法(1979)校正P值。

1.4.2 聚类分析 利用factoextra包的hclust函数,采用average法对384份种质材料的综合评价值进行层次聚类。

1.4.3 方差分析 利用car包的aov函数进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 棉花子叶期耐低钾能力鉴定

本研究采用的9个耐低钾鉴定指标均存在不同程度的基因型差异。缺钾斑相对面积的变异系数最大, 达到了96.24%, 分布于0～83.0% (表1和图3-A),表明该指标对低钾胁迫具有强烈的指示作用; 子叶与下胚轴夹角的变异系数为31.52%, 分布于4.5～75.5°之间(表1和图3-B), 表明缺钾导致子叶发生不同程度的萎蔫; 根系形态参数(根长、根表面积、平均根直径和根体积)的变异系数在16.6%～27.8%之间变动, 且均呈正偏分布(表1和图3-C～F), 表明50%左右种质材料的根系生长低于平均水平; 3个生理指标(植株干重、K+浓度、K+积累量)的变异系数在14.73%～19.28%之间变动, 均呈正态分布(表1和图3-G～I), 表明其可作为供试种质材料耐低钾能力的鉴定指标。

(图3)

2.2 棉花子叶期耐低钾能力各评价指标间的相关性分析

由表2可知, 缺钾斑相对面积与子叶与下胚轴夹角呈显著负相关, 表明低钾胁迫下子叶缺钾斑越少、萎蔫程度越轻; 植株干重与根系总长度、总表面积及总体积呈显著正相关, 表明低钾胁迫下根量越大越有利于幼苗生长; 根系总长度、总表面积与K+浓度和K+积累量呈显著正相关, 表明低钾胁迫下根系长度的增加以及根系表面积的扩大有利于幼苗对K+的吸收。

表2 棉花子叶期耐低钾能力各评价指标相关性分析Table 2 Correlation analysis among evaluation index of low potassium tolerance at cotyledonary stage of cotton

2.3 利用AHP-隶属函数模型鉴定供试种质材料的耐低钾能力

2.3.1 构建判断矩阵A 根据变异分析、相关性分析以及前人经验, 利用比较尺度法, 构建判断矩阵A (表3)。对鉴定指标中缺钾斑相对面积(%)、子叶与下胚轴夹角(°)、根系总长度(cm)、根系总表面积(cm2)、根系总体积(cm3)、植株干重(g)和K+浓度(mg g–1)进行相互比较, 缺钾斑相对面积与子叶与下胚轴夹角同为表型指标, 但根据差异分析(表1)发现,前者变异系数是后者3倍多, 表明前者低钾指示作用更加灵敏, 因此两者之间重要程度为2∶1。生物量是作物生长发育过程的最终结果体现, 因此植株干重相比于缺钾斑相对面积重要程度为3。根系总长度、根系总表面积和根系总体积分别从3个维度来反映根系生长发育情况, 而缺钾斑相对面积是对根系以上部分的生理状态, 与根系形态参数之间比较重要程度相当。子叶缺钾斑的形成是钾素缺乏所导致的, 并且结合相关性分析, 表明钾含量与缺钾斑的形成存在因果关系, 因此钾含量的重要程度要高, 但其重要程度要低于植株干重, 因为钾素最终是转化为生长发育过程中干物质的积累, 因此钾含量与缺钾斑相对面积的重要程度比值为2∶1。平均根直径和K+积累量未入选判断矩阵, 原因在于前者与K+浓度和K+积累量不相关, 且其变异系数最小;而后者和植株干重高度相关, 为了减少数据冗余对其进行了剔除。

表3 棉花子叶期耐低钾能力评价指标之间重要性比较Table 3 Comparison of importance among evaluation index of low potassium tolerance at cotyledonary stage of cotton

2.3.2 计算权重并检验判断矩阵 由表4可知,权向量Wi即为评价指标的权重值, 其中植株干重权重值最大为0.3208, 子叶与下胚轴夹角权重值最小为0.0513。CR值(一致性比率)为0.0154, 远小于0.1, 表明判断矩阵一致性检验通过, 判断矩阵构建合理。

表4 棉花子叶期耐低钾能力评价指标权重向量计算及检验Table 4 Weight vector calculation and test of evaluation index of low potassium tolerance at cotyledonary stage of cotton

表6 部分供试种质材料的种仁和种壳K+浓度Table 6 Potassium concentration in kernel and hull of cotton seed of partial tested germplasms

2.3.3 隶属函数综合评价值C及聚类分析 根据隶属函数综合评价值C, 384份种质材料耐低钾能力排名如附表1所示, 其中K129 (无极一枝花)的综合评价值C为0.7868, 排名第1; K355 (棕1-61)和K141 (黑山棉1号)分别位于第2和第3位。K42(巴西014)的综合评价值C为0.2451, 为倒数第1名, K272 (石抗39)和K63 (三江八江大花)分别为倒数第2和第3名。

根据频次分析(图4), 隶属函数综合评价值C在0.43～0.52之间的分布频次最高, 为34.6%, 表明约1/3的种质材料具中等水平的耐低钾能力; 而最耐低钾(C值为0.70～0.79)和最不耐低钾(C值为0.25～0.34)的种质材料均较少, 占供试材料的比例分别为1.3%和3.6%。系统聚类分析将供试种质材料划分为3大类(图5), 其中5份供试种质材料耐低钾能力最强,占比1.3%, 13份供试种质材料最不耐低钾, 占比3.4%, 这与频次分析结果相近, 表明AHP-隶属函数法计算出的综合评价值C可用来筛选和分类。

图4 供试棉花种质材料子叶期综合耐低钾能力的频次分布Fig. 4 Frequency distribution of low potassium tolerance of tested cotton germplasms at cotyledonary stage

图5 种质材料耐低钾能力的聚类分析Fig. 5 Cluster analysis of low potassium tolerance of tested cotton germplasms at cotyledonary stage

2.6 部分种质材料的种仁和种壳K+浓度

为了明确棉花子叶期耐低钾能力是否受种子K+浓度的影响, 通过随机抽样法抽取24份种质材料,分别测定其种仁和种壳的K+浓度(表5)。结果表明,种仁K+浓度变化幅度在11.7～16.2 mg g–1之间, 种壳K+浓度变化幅度在7.7～12.9 mg g–1之间, 不同种质材料的种仁和种壳K+浓度差异不显著。此外, 种仁和种壳K+浓度与种质材料的耐低钾能力(隶属函数综合评价值C)无相关关系(数据未展示), 表明种子K+浓度不影响种质材料的耐低钾能力。

3 讨论

3.1 棉花子叶期耐低钾能力评价指标的确定

棉花钾营养效率受多基因调控, 因此需选取多种评价指标才能全面反映种质材料响应钾胁迫的能力, 从而增加鉴定结果的准确性[18]。生物量是评价养分效率最重要且最常用的指标[19], 因此本文赋予植株干重的权重值最大。K+浓度、K+积累量等作为评价指标也常被采用[20]。姜存仓等[21]、田晓莉等[22]的研究表明, 作物养分含量、养分积累量、生物量等生理指标来对种质材料进行耐低钾鉴定, 他们的结果还表明低钾胁迫下表现好的种质材料, 其钾营养效率也高, 说明耐低钾能力与养分营养效率之间是相关联的。此外, 当棉花子叶期遭受低钾胁迫时,子叶会出现水渍状的不规则失绿圆斑, 这是典型的棉花缺钾症状, 并且不同种质材料子叶缺钾斑出现的时间与大小都各不相同, 说明缺钾斑可用来比较棉花子叶期的耐低钾能力[15]。子叶与下胚轴的夹角反映子叶的萎蔫程度, 夹角越小, 萎蔫程度越重。这是由于低钾胁迫影响幼苗子叶柄的生长发育, 减少了子叶柄中维管束和木质部的导管数量[23], 降低了子叶柄的机械硬度和韧性, 从而影响叶柄对子叶的支撑作用, 使子叶在重力作用下下垂。不同种质材料子叶与下胚轴的夹角在缺钾条件下也各有差异, 同时子叶与下胚轴夹角与缺钾斑相对面积具有极显著负相关关系(r= –0.56***), 这表明子叶与下胚轴夹角同样可以作为表型评价指标进行参考。根系形态(根长、根表面积等)在一定程度上决定植株吸收养分的能力,常作为评价植物养分效率的指标[24-25]。通过相关性分析发现, 根系总长度与根系总表面积、根系总体积呈正相关, 与平均根直径呈负相关, 这是由于根表面积以及根体积的测量计算均与根系长度有关, 表面积和体积会随着根系长度的增加而增加。

3.2 综合比较耐低钾能力数学方法的选取

利用多个评价指标来考察种质材料的耐低钾能力, 需明确各评价指标在体系中的重要程度, 根据指标的优先级确定权重分配。目前常见的赋权方法有3种: 主成分分析法(PCA)、AHP层次分析法和熵权法[26]。

PCA是一种基于数据相关性的、客观的赋权方法, 而本文结果表明棉花子叶期耐低钾能力评价指标相互之间的相关程度并不高, 不适合进行主成分分析。熵权法实质上是基于评价指标的变异情况来进行赋权, 而植株干重作为本研究最重要的评价指标, 其变异系数最小, 表明熵值不高, 因此在体系中的权重值也不会高, 这不符合我们的预期以及实际生产要求。本文采用了AHP层次分析法来进行赋权, 因为种质材料的筛选是为满足研究者试验目的所进行的主观活动, 评价指标的赋权需结合作物客观生长发育规律及实际生产活动来进行, 即需要借鉴专家经验并结合前人数据资料进行分析。

3.3 种子含K+量与子叶期耐低钾能力的关系

种子的养分含量会影响幼苗的生长[27], 如种子含氮量高有利于缓解低氮胁迫对幼苗生长的抑制作用, 并可加快幼苗对外源氮素的吸收[28-30]; 玉米幼苗叶片与根系的磷含量随着种子磷含量的增加而增加[31-32]; 菜豆的磷营养效率基因型差异与种子磷含量密切相关[33]; 耐低钾能力强的籼稻种子具有较高的钾含量[34]。然而, 本研究发现随机抽取的24份种质材料种子各部分(种壳、种仁)的K+含量在基因型间无显著差异, 与子叶期综合耐低钾能力(隶属函数综合评价值)也无显著相关关系, 这与田晓莉等[22]研究结果相似。当然, 这一结果也可能与本研究抽取的样本量较小有关, 因此对于种子K+含量与其子叶期耐低钾能力的关系还需要进一步的研究。

3.4 不足与展望

在棉花子叶期进行耐低钾能力鉴定可加快筛选效率, 但子叶期处于棉花生长早期, 不能完全代表棉花全生育期的生长发育特性, 因此需要对本研究方法筛选出来的代表种质材料在田间进行全生育期鉴定。此外, 选取的鉴定指标不同、对各指标的赋权不同, 最后的鉴定结果也会存在差异。本研究选取的指标和赋予各指标的权重是否适宜, 也需要通过田间全生育期鉴定进行检验。经田间试验验证的耐低钾材料和低钾敏感材料可用来进行基因型差异机制研究, 将会更好地指导耐低钾品种的培育及耐低钾栽培措施的制定。

4 结论

本文以384份棉花种质材料为供试对象, 在子叶期采用子叶缺钾斑相对面积、子叶与下胚轴夹角、植株干重、根系总长度、根系总表面积、根系总体积和K+浓度等7个指标综合评价供试种质的耐低钾能力。利用变异系数、相关性对评价指标进行分析,采用AHP层次分析法对指标进行赋权, 运用隶属函数法进行综合评价, 综合两者构建AHP-隶属函数决策模型, 划分出耐低钾能力强的材料5份、耐低钾能力中等的材料366份及低钾敏感材料13份, 其中耐低钾能力最强的3份种质材料为K129 (无极一枝花)、K355 (棕1-61)和K141 (黑山棉1号), 对低钾最敏感的3份种质材料为K42 (巴西014)、K272 (石抗39)和K63 (三江八江大花)。此外, 种子K+浓度与子叶期的耐低钾能力无显著相关关系。

附表请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb.chinacrops.org/; 2) 中国知网http://www.cnki.net/;3) 万方数据http://c.wanfangdata.com.cn/Periodicalzuowxb.aspx。