蛋白质聚集在白内障发病中的作用研究进展△

郭昭兴 万修华

白内障是目前全球首要致盲眼病[1],其特点是晶状体混浊引起的进行性视力下降。一般认为,晶状体蛋白质聚集是白内障发病中的一个重要过程。晶状体蛋白分为水溶性和非水溶性两种,水溶性蛋白含量降低和非水溶性蛋白含量升高均可导致白内障。

生理状态下的晶状体是具有屈光功能的透明组织,由大量晶状体蛋白规律排布构成。晶状体蛋白分为 α-、β-和γ-晶状体蛋白 3 个亚家族。其中α-晶状体蛋白属于小热休克蛋白,具有分子伴侣功能,可辅助其他晶状体蛋白正确折叠从而抑制蛋白质聚集[2]。β-和γ-晶状体蛋白是晶状体主要的结构蛋白,主要维持晶状体的结构和功能[3-4]。

蛋白质聚集的原因并非一个新兴的研究方向,其中涉及的具体机制目前仍未完全清楚[5]。近些年随着液相色谱-质谱法、核磁共振波谱法、分子动力学模拟等技术的广泛应用,有关蛋白质聚集的研究不断深入。此外,研究人员针对抗蛋白质聚集途径筛选出了有效的化合物,这为白内障药物研发提供了新的思路。基因突变、异构化与共价修饰、化合物和离子作用、蛋白质相互作用均是蛋白质聚集发生的原因。本文围绕上述四点对蛋白质聚集在白内障发病中的作用研究进展进行综述,以期为后续研究提供资料和参考。

1 基因突变

白内障致病突变在先天性白内障的发病过程中扮演着重要角色[6],其致病机制具有较高的研究价值。Qi等[7]研究发现,S228P突变可分离βB1-晶状体蛋白C端结构域中的两个高度保守的相互作用环,从而将疏水核心与天然βB1-晶状体蛋白中的溶剂隔离开来。重新折叠的S228P突变蛋白具有更少的堆积结构和未淬灭的色氨酸荧光团,同时有着更多的疏水基团暴露。在生理温度下S228P突变蛋白容易聚集,降低了βB1-晶状体蛋白对βA3-晶状体蛋白的保护作用。Zhao等[8]发现两个先天性白内障致病突变W59C和W151C均可以破坏保守的色氨酸残基从而极大降低βB2-晶状体蛋白的溶解度及对热和盐酸胍的稳定性。Zhu等[9]通过光谱实验也得出类似的结果,G75V突变体有更多的色氨酸荧光团和疏水性暴露基团。突变体γS-晶状体蛋白的变异体更容易受到热处理、盐酸胍和酸性条件的影响。除上述几个实验外,Xu等[10]发现的S31W和R145W突变、Fu等[11]发现的L45P和Y46D突变、Ren等[12]发现的S93R突变经过光谱实验和动态分子模拟论证,几乎都能改变β/γ-晶状体蛋白中的四个保守的色氨酸残基暴露基团,进而影响β/γ-晶状体蛋白结构,造成晶状体蛋白质聚集,该途径可能与先天性白内障的发病息息相关。

2 异构化与共价修饰

2.1 天冬氨酸异构化

α-晶状体蛋白由αA-和αB-两个亚基组成,在晶状体蛋白合成过程中发挥分子伴侣功能,可辅助晶状体蛋白正确折叠。此前有研究发现,老年人αB-晶状体蛋白中的天冬氨酸(Asp)存在异常量的异构化(Asp96)。为探究Asp96异构化的影响,Takata等[13]将αB-晶状体蛋白的残基93-103合成肽链,其中L-α-Asp被L-β-Asp、D-α-Asp或D-β-Asp取代,生物学测定结果显示,Asp96的异构化可以改变肽链的局部结构及其对酶消化的稳定性。Fujii等[14]则利用液相色谱-质谱法测定αA-晶状体蛋白中Asp58、Asp91/92和Asp151异构体的比例,结果表明,非水溶性物异构体比例最多,高分子量蛋白质聚集体次之,α-晶状体蛋白最少。因此,Asp在α-晶状体蛋白中的异构化可能是蛋白质聚集的触发因素,会导致白内障的形成。

2.2 谷氨酰胺脱酰胺

除Asp异构化以外,αA-晶状体蛋白中谷氨酰胺(Glu)的脱酰胺反应在年龄相关性白内障患者晶状体中也很常见。这种修饰在白内障患者晶状体不溶性部分中非常普遍,可能与白内障形成相关。Ray等[15]测定了Glu147脱酰胺对αA-晶状体在体外伴侣能力的影响。Glu147脱酰胺的αA-晶状体蛋白的伴侣能力略有降低,其中心α-晶状体结构域的整体结构略有破坏,显示出形成低聚物的趋势。由于αA-晶状体蛋白占比最多,即使是很小的功能丧失也可能导致晶状体混浊。

2.3 天冬酰胺脱酰胺

Forsythe等[16]研究发现,从老化晶状体分离的不溶性蛋白质内的γS-晶状体蛋白存在天冬酰胺(Asn)高度脱酰胺(Asn14和Asn76)现象。这些位点位于N端结构域的表面,研究人员采用Asp残基替换Asn,可产生重组人γS-脱酰胺突变体。对比发现,突变体的光散射增加,热诱导变性过程中出现蛋白质聚集。Vetter等[17]则通过在N14、N76和N143三处位点模拟脱酰胺过程,并通过动态光散射,化学和热变性,氢-氘交换和对二硫键交联的敏感性评估Asn脱酰胺对γS-晶状体蛋白生理特性的影响,结果显示,少量脱酰胺突变体迅速聚集成大型光散射物质,它们是造成晶状体光散射的主要成分;在盐酸胍或高温下,脱酰胺可加速蛋白质的展开和聚集,并增加蛋白质对氧化的敏感性。此外,三重突变体更加不稳定,说明脱酰胺的影响具有累积性。

2.4 甲基乙二醛修饰

αA-晶状体蛋白中的G98R突变与年龄相关性白内障的发生同样存在联系。研究表明,突变蛋白结构改变,稳定性降低,寡聚体大小增加,伴侣样活性丧失以及对蛋白水解的易感性升高可能是白内障形成的促成因素[12]。Santhoshkumar等[18]研究发现,用低浓度(50 μmol·L-1)的甲基乙二醛(MGO)修饰蛋白质,可以提高αAG98突变体的稳定性和伴侣活性。将αAG98R蛋白(1 g·L-1)在无菌条件下于37 ℃孵育30 d会导致突变蛋白沉淀,而用50 μmol·L-1MGO修饰的突变蛋白则能保持稳定的可溶性和透明性。上述结果提示低浓度MGO修饰在稳定突变伴侣蛋白方面具有潜在作用。

2.5 泛素化修饰

年龄相关性白内障主要与紫外线-B(UVB)诱导的蛋白质氧化损伤关系密切。错配修复蛋白3(MSH3)作为错配修复家族的关键成员,主要维持基因组稳定性。然而,目前人们对MSH3的功能及维持MSH3蛋白质平衡的机制仍然未知。Chen等[19]最新研究发现,暴露在UVB下,年龄相关性白内障标本和SRA01/04细胞中MSH3的蛋白表达水平降低。MSH3的异位表达显著阻碍了UVB诱导的细胞凋亡,而MSH3水平下降则会促进细胞凋亡。蛋白质半衰期测定显示,UVB照射可通过泛素化和降解作用加速降低MSH3水平。此外,研究人员发现,E3泛素连接酶合成滑膜蛋白(SYVN1)可与MSH3相互作用,促进后者泛素化和降解。综上,年龄相关性白内障的发病机制可能涉及SYVN1介导的MSH3泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径,针对SYVN1的干预措施很有可能成为年龄相关性白内障的潜在治疗方向。另有研究[20]表明,E3泛素连接酶RING指蛋白157(RNF157)会与肿瘤抗原p53相互作用从而调控晶状体上皮细胞的凋亡。RNF157可引起p53的泛素化和降解,降低RNF157表达则会上调p53的表达进而促进晶状体上皮细胞凋亡。由此看来,对RNF157表达的调节可以作为白内障潜在的治疗策略。

3 化合物和离子作用

目前,针对白内障的治疗仍以手术为主,探寻有效的白内障药物始终是科研人员关注的课题。2015年Zhao等[21]报道,在体外和细胞转染实验中利用羊毛甾醇处理均可降低预制蛋白质聚集体的含量。进一步实验表明,通过羊毛甾醇治疗可以提高离体兔眼白内障晶状体和狗在体白内障晶状体的透明度。这一研究在白内障药物研发方面具有重要意义,相关研究结果为白内障药物研制开辟出了新的思路。Makley等[22]围绕甾醇类物质进一步开展研究,通过热稳定性测定,该团队鉴定了一类可结合α-晶状体蛋白并在体外逆转其聚集的分子。人们通过差式扫描荧光法发现25羟基胆固醇可以改善R49C和R120G突变所致遗传性白内障小鼠模型中晶状体的透明度。更为重要的是,它还部分恢复了老年小鼠在体晶状体和人离体晶状体中的蛋白质溶解度,这提示25羟基胆固醇可作为药物应用于年龄相关性白内障的预防和治疗。Chen等[23]在上述两项研究的基础上对羊毛甾醇和25羟基胆固醇的有效性进行了离体组织定量研究。实验材料选取了通过手术分离出的人白内障患者晶状体中的蛋白质聚集体。用两种化合物分别处理样品,二者均对蛋白质聚集体的溶解有效,且有效性与白内障严重程度相关。另有研究[24]表明,人眼晶状体代谢物肌醇作为天然的化学伴侣可抑制晶状体蛋白的聚集。代谢组学证据表明,与年龄匹配的对照组相比,人类白内障患者晶状体的肌醇被严重耗尽。通过维持人眼晶状体内正常肌醇水平可预防或延缓晶状体混浊。

金属离子的暴露则是白内障形成过程中的另一个危险因素。Quintanar等[25]发现Cu2+和Zn2+离子都可诱导人γD-晶状体蛋白快速非淀粉样聚集,形成高分子量的轻散射聚集体。Cu2+离子可降低人γD-晶状体蛋白的热稳定性,促进二硫键桥接二聚体的形成。Ramkumar等[26]也通过实验得到了类似的结果。值得注意的是,这种金属离子诱导的聚集都强烈依赖于温度,并且可被αB-晶状体蛋白抑制。Domínguez-Calva等[27]将金属-晶状体蛋白相互作用的研究扩展到重金属离子,如二价铅、镉和汞。使用浊度测定、电子显微镜、电子吸收和圆二色光谱评估这些重金属离子在三种同源人γ-晶状体蛋白的非淀粉样蛋白质聚集中的作用。结果表明,Hg2+离子可以诱导人γC-和γS-晶状体蛋白的非淀粉样蛋白质聚集,但不能诱导γD-晶状体蛋白质聚集。汞诱导蛋白质聚集的机制包括直接的金属-蛋白质相互作用、热稳定性丧失、蛋白质N端结构域的部分展开以及二硫键桥接二聚体的形成。Ramirez-Bello等[28]评估了Cu2+和Zn2+离子对βA1-蛋白(酸性蛋白代表)和βB2-蛋白(碱性蛋白代表)聚集的影响,结果表明,Cu2+离子诱导βA1-晶状体蛋白的构象变化很小,导致高分子量的轻散射聚集体形成,而Zn2+离子对βB2-晶状体蛋白更具侵略性且可诱导更大的构象变化。

4 蛋白质相互作用

晶状体内含有高浓度的晶状体蛋白,因此其也是最拥挤的生物环境之一。此前许多研究已经探讨了αB-晶状体蛋白在体外稀释条件下的结构和功能,但拥挤对这些方面的影响尚不清楚。Grosas等[29]以多糖Ficoll400和牛γ-晶状体蛋白为拥挤剂,采用生物物理方法,研究了αB-晶状体蛋白在拥挤环境下的结构和伴侣能力,结果表明,αB-晶状体蛋白会出现展开,形成低聚状态,其热稳定性和伴侣能力降低。然而,αA-晶状体蛋白的存在可以稳定αB-晶状体蛋白的聚集。这初步揭示了晶状体蛋白质相互作用对于蛋白质聚集造成的影响。Schmid等[30]则通过对来自不同小鼠品系α-、β-或γ-晶状体蛋白的点突变进行分析发现,这些晶状体蛋白在体外是不稳定的。它们的含量在晶状体中大大降低,且它们的非水溶性部分不会积聚。相反,所有其他晶状体蛋白,包括α-晶状体蛋白都发生了沉淀。在突变晶状体中观察到的晶状体蛋白质组成和空间组织的变化表明,晶状体蛋白质组的不平衡和晶状体蛋白相互作用的改变是白内障形成的基础,并非突变晶状体蛋白本身具有的聚集倾向,分子伴侣池的耗尽最终会导致晶状体混浊。该团队创新性地从蛋白质组的角度出发对蛋白质聚集进行了解释,晶状体蛋白间的相互作用成为研究蛋白质聚集过程中的一个独立因素。

5 结束语

应用基因测序技术和其他分子生物学技术,人们将先天性白内障所涉及的基因突变位点及突变对晶状体蛋白结构造成的影响逐渐揭示清楚。目前,多种共价修饰在年龄相关性白内障发生过程中的意义已被阐明,通过抗蛋白质聚集途径逆转白内障的化合物也已成功筛选。值得注意的是,仅从基因突变的角度出发去解释先天性白内障的发病机制是远远不够的。基因的表达涉及多个步骤,任一步均有可能造成蛋白质的错误折叠和聚集。眼科科研人员同时也应关注后续基因转录及晶状体蛋白翻译过程,系统评估先天性白内障可能的致病环节。白内障成药的潜在化合物虽已找到,但目前并没有形成具体的药物制剂,更没有开展临床试验。针对年龄相关性白内障可能的干预位点目前也没有更进一步的研究验证其可行性。希望未来能有更多白内障药物进入临床应用,早日将实验室获得的研究成果应用于临床实践。诚然,通过抗蛋白质聚集这一途径预防或治疗白内障还需要克服很多困难。不过随着研究的深入,蛋白质聚集涉及的分子机制会更加完善,未来白内障的预防和治疗将会得到更全面的扩展。